Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 63
Текст из файла (страница 63)
3. Важность правильной м олиф икаци и белков для их функциональной активности в эукариотах отмечалась выше. Это явление менее выражено в бактериях, а имеющиеся у них для этой цели собственные фермешгы не узнают или модифицируют неправильно чужеродные белки. Поэтому, если получаемый в бактериях эукариотический белок необходим в активной форме, то клонируют ген, в котором сохранена только требуемая для этого нуклеотилная последовательность. В случае же дальнейшего использования белка в родственных для него клетках клопируемый ген может содержать информацию о белке-предшественнике в надежде на то, что при его послелующем использовании он булет правилыю модифицирован рл хгяо.
4. Способность бактерий секретировать белки является их пенным (но релким) качеством, позволяюн1им не проводить при получении белков трудоемкую операцию по вскрытию клеток. Механизм секреции белков схолен как у про-„твк и у эукариот. У бактерий клеточная стенка отделена от цитоплазмы цитоплазматической мембраной, строение которой сходно со строением плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума у эукариотических клеток. Грамположительные клетки обладают только питоплазматической мембраной. У грамотрицагельпых бактерий имеется лополнительная внешняя мембрана, между внутренней (питоплазматической) и внешней мембранами расположены клеточная стенка и периплазматическое пространство.
Болылинство белков, сиепезируемых бактериальпыми клетками, функционируют в их цитоплазме. Однако ряд белков предназначен для работы в мембранах, периплазме и даже вне клетки (рис. 10.2), поэтому они облалают способностью к Глава 1О. Бактерии 327 11срип ьыик ""ВнГз рянняя нсибрана Цюоп ~азия а,,у -Р Сш пильпая Зрелыи послсдояателызость '~ ~Л белок Рибосол.а ~-з 1Папероннн Ф Липерная иии сипнальная пептипаза я' Тралслокатор Г' л '.:;., Нзпьотныи белок Рнс. 10.2 Механизм секреции белков у Е со11.
В левом нижнем углу схемы стрелками указаны возможные места конечной локализации белков секреции. Их экспорт осуществляется специальными механизьзами„которые различны для преодоления цитоплазматической мембраны и для транспорта через внешнюю мембрану (у грамотрицательных клеток). У болыпинства секретируемых белков, как про-, так и эукарИОт Па )т(-КОНЦЕ НаХОЛНтея таК НаЗЫВаЕМая СНП1аЛЬНая ПОСЛЕдО- вательность, способствуклцая проникновению белка через цитоплазматическую мембрану (у прокариот) нлн через мембраны лндоплазматнческой сети (у эукариот). У мембрацосвязанных белков сигнальная последовательность обычно сохраняется, а у белков, поступивших в периплазму или среду, эта последовательность отщепляется.
Функция сигнальной последовательности обусловлена ее строением. Эта последовательность ллиной в среднем 20 — 25 амино- 328 г!асть 111. Эненреееия чужерог1ньк генов кислот состоит из трсх участков: п (!9-концевой), Ь (гидрофобный) и с (С-концсвой). Участки нс имеют консервативных псклсдоватслыюсгсй. Размер и-учасгка варьирует от 1 ло 17 аминокислотных остатков, !з-участка — от 7 до 16, а с-участок характсризустся сравнитсльпо постоянным числом: 5 у прокариот и 6 у эукариот (Нс!1пс, ! 985). Первый участок включает прсимущсствсшю положительно заряжснныс аминокислотныс остатки, второй — гидрофобныс.
Очевидно, именно !з-участок взаимодсйствуст с внутренним нсполярным слоем мембраны и «протаскиваст» через нес молскулу белка, а с-участок указываст на место отщеплсния сигнальной послсдоватсльности. Послслнис три аминокислоты с-участка являются сайтом процсссинга, консенсус которого А(а-Х-А)а (в положении — 3 и -! находятся аминокислоты с маленькими нсразвствлснными нсзаряжсппыми радикалами). Сигнальные лослсдоватслытсти белков грамгюложитсльных клеток псмного отличны от вышеописанных. Все их три участка длиннсс, а 1ч-консц имеет больший положительный заряд. Волки, консчно, сскрстируются нспосрсдствснно в среду. У грамотрицатсльных клеток извсстны три механизма, обеспсчивающих процесс секреции.
Два из них являются двухэтапными и функционируют с белками, у которых есть лилсрная послсдовательность. Псрвый этап у них одинаков, а второй — различсн. В Е со!1 первый этап обсспсчивают несколько бслков (см. рис. 10.2). Шапсронины (белки теплового шока) способствуют нужной укладке г(-конца сскрстирусмого полипсптида, белки ВссА и РгЮ направлякп полипсптид к сскрсторному каналу — транслокатору, интегрированному во внутреннюю мембрану и составленному из белков ЯссЕ, Васу, РВА и Рг! О.
Процсссинг полипсптида ведут две псптидазы — лидсрная и лигюпротеин-сигнальная. Транслокация белка через мембрану в большей части случасв сопряжена с ого синтсзом, но может происходить и после трансляции. Второй этап секреции — транспорт через внсшнкзю мембрану — происходит с помощью специального комплекса белков или бсз них. Третий механизм использует сскрстирующисся белки, у которых вгюбще нет лидсрной послсдоватсльности. Они переносятся через обс мембраны АВС-транспортерами, являющимися АТФ-зависимыми белками (см.
обзор КисЫсг, 1993). Глава 1О. Нахтерия 329 При конструировании продуцентов клонируемые гены подсоединяют к участкам ДНК, кодирующим сигнальные последовательности секрстирусмых белков. В экспериментах с клетками Е. сор для этого используют сигнальные послеловатсльцости р-лактамазы илн щелочной фосфатазы. Первые опыты полобного рода были слеланы с геном проицсулина крысы, который был внедрен в Рх11-сайт гена р-лактамазы, образованный сразу после его сигналыюй последовательности (Та1пзас18е, С)11беП, 1980).
Это привело к секреции в периплазматическое пространство гибридного белка, содержащего проипсулин. В той же работе обнаружено, что эукариотичсские белки с собственными сигнальными последовательностями могут секретироваться клетками Е. со11 и что эти последовательности узнаются и отщепляются бактсриальыыми ферментами. В системах, исгюльзуюших секретируюшисся белки, важна их стабильность и в культуральной среде.
Клетки бацилл секретируют наряду с другими белками также протеазы, к которым собственные белки устойчивы. Конструирование штамма й. хиЫ11з, в котором отсутствовали все шесть его внсклеточных протеаз, позволило увеличить время полураспада В-лактамазы с 1,5 до 85 ч (%ц е1 а1., 1991). Подходы к конструированию экспреесиониых векторов Плазмидлые векогоры.
Как уже отмечалось, для клонирования и экспрессии генов в клетках Е. со11 обычно применяют различныс модификации вектора рВЮ22, содержащие промоторы фага ), лактозного и триптофацового оперона и их операторные у ~астки. Благоларя гюследним экспрессию клонируемых генов можно регулировать, если плазмидная или бактериальная ДНК несет гены соответствующих репрессоров. Из многих вышеперечисленных факторов, влияющих на экспрессию генов, решающими яшчяются сила промотора и структура сайта связывания рибосом (КВБ-сайта). Нагюмним, что этот сайт включает в себя начальныс колоны гена, поэтому нет простых путей, обеспечивающих эффективную экспрессию чужеродных генов в бактериях Такой экспрессии добиваются двумя принципиалыю различными подходами (схемами) — путем 330 Часть И1.
Зкелреееия чужеродлмх генов Ро ,и ИхГ мрнк Гибриииый белок ынк Гибрилиыб белок бл> ынк КС)"5.О.'()О орик Д О:ДДД)З Волок Рис. 10.3. Схемы клонирования чужеролных генов, позволяющие получать гибридные (а) или индивидуаяьныс (б) белки. Представлены варианты интеграции в 5 '-(а-т) и 3'-(а-2) концы векторного гена, а также моноцистрщщая (б-)) и двуцистронная (б-х) конструкпии. р — промотор; о --- оператор;ЯЗ вЂ” последовательность Шайна— Далгарно; 1 — терминатор транскрипции; > — инициирующий кодон; я — терминирующий кодон. Целевые гены и белки выделены ббльшим размером их внедрения в экспрессирующийся ген вектора (рис. 10.3, а) и путем подстановки генов пол промотор и последовательность Шайна— Далгарно вектора (рис.
10.3,6). Каждая из схем имеет свои преимущества и нсдосгвтки. При использовании схемы и ам обычно достигается приролная для векторного гена эффективность трансляции, однако приходится преодолевать две трудности. Во-первых, клонирусмый ген может оказаться не в рамке колонов векторного гена„и содержащаяся в пем генетическая Глава 1О. Биктерии 331 информация будет "прочтена" певсргю. С целью поиска правильной рамки считывания интеграцию чужсролного гена в векторный ген осуществляют через разные сайты рестрикции полилинкера или используют специализированные векторы.Так, на базе плазмиды рВВ322, содержащей промотор и начальный участок гена lасХ, создана серия из трех векторов рРСб1-3, в которых ЕсиК1-сайт находится на расстояниях, соответственно, 21, 23 или 25 п.н.
от инициирующего колона 1рис. 10.4,и) Ясно, что хотя бы в одном из векторов рамка считывания окажется подходящей для экспрессии внедренного через ЕсоИ-сайт гена. Если жс ген экспрессируется во всех трех векторах, значит, клонируемая ДНК несет собственный сайт связывания рибосом. Во-вторых, использование схемы "а" приводит к образованию гибридного, или слитого 1Гпяоп) полипсптила, в котором чужеролная для клетки, но целевая лля исследователя аминокислотная последовательность располагается на С-конце молекулы.
Как правило, чужеродный белок в гибридной форме нефункционалсн, но его антигенная структура сохраняется. Таким образом, для некоторых аналитических целей гибрилный полипептид может быть использован. Чтобы получить чужеродный белок в индивидуальной форме, его отщепляют от гибридного полипептида с помощью специфических эндопептилаз и других реагентов (табл. 10.2).
Например, в векторе М13тр!1РХ клони- рована последовательность ВигиН1 11е О1в С1у Агяч. 6СА ТССАТСОАСтССТАООССТАСССТССАТГ 6А ТСС ССТА ССг ТАС СТС ССА ТСС СтС)А ТС)С1 БАС СТЛ ССТА 6Гп Агре С1п 11с ВишН! в которую по ровным концам Вги!-сайта (полчеркпут) можно интегрировать целевой ген. При этом аминокислотной послеловательности целевого гена булст предшествовать тетрапептил 11е-С!в-С)у-Ага, распознаваемый и отщепляемый фактором коагуляции крови Х,. Включение этой конструкции по ВатН1-сайту в экспрессионный вектор позволяет получить гибридный белок, из которого затем ш игго выделяют инливилуальный целевой белок. 332 Часть 111.
Экспрессо)г чуэсеродньа генов СОО ОСА АЗТС ОЗ осолАттс нз зььтсггАсслгхнс слхттс )а) тхатотоооггахлс в:аш 2)аг тат СЛАЛ)ьь О О ЕБ Х и С ва г) в) Вввяд наи л) Рис )04 Схемы зкспрссспонных векторов лля клеток Е сс)г а — векторы РРС(г)-3 с тремя различными рамками считывания клонируемых генов, б — векторы РЕ К278 (288, 289), предпазначенныс лля синтеза слитых бедков с функциональной )4-ко)щелей частью и обеспечивающие возмохгность выбора правильной рамки считывания„ е — векторы рКВЕ'1' (А,В,С), обеспечивающие с помощью полигистидинового тракта (Нв)в очиспсу клонировашюго гибридного белка и глделсние целевого белка с использованием сайш ЕК; г — вектор рАВ), обеспечивающий синтез индивидуального белка при клонировании целевого гена через сайг ))атН), д — векгоры рЕТ-3 (адис), обеспечивающие си)пез Глава 10 Бакглерии ЗЗЗ иидивидуальпых (при клоии1ювации через саит Фг(е!) или сяитых (через сайт Ватн!) белков, е — вектор рТА1529, предиазцачсниый для секреции целевых белков р — промотор, ! — зермииатор траискрипции; Зб— сигнальная послсдовательиосзь, Ь вЂ” ииициирук>ший кодов„МС — сайт поликлоиироваиия, ЕК вЂ” сайт расщеплеиия белка зитсрокипазой;  — Ваган!, Б — Бал, Х вЂ” ХЬа1; Н вЂ” Илгбц, С вЂ” С/а1, ч(0 — элемситы гсиа !Вбита Тт П!рифтом выделен ЕеоК1-саит Стрелка у промотора обозиачаст направление траискриппии В зависимости от цели клонирования схему '"а"' применяют в двух вариантах: интеграцию чужеродного гена проводят около 5'- (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
