Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 67
Текст из файла (страница 67)
В качестве примера рассмотрим систему из двух векторов, разработанную в лаборатории Коэна в 1981 голу. Основной вектор р))В! О! 0 в данном случае имеет промотор-операторный у часток и сайт связывания рибосом лактозного оперона, причем рялом с ним через ВатН1-сайт можно интегрировать клонируемые гены. Репликационная система этого вектора, полученного на базе плазмиды рКХ402 (плазмида типа гнп-авау, см. гл. 3), способна повышать число копий векзора от 20-50 ло 2000 при изменении температуры от 30 ' до 35 С.
Вспомогательный вектор р)351002 имеет термочувствительную систему ренликации и солержит генрепрессор (асВ (см. с. 3!8). Клетки, содержагцие оба вектора, активно размножаются при 30 "С, поскольку экспрессия клонируемого гена в таких условиях блокируется репрессором. При определенной плотносги клеточной популяции температуру культуральной срелы повышают. Это приводит к элиминации вектора рИЯ!002, резкому увеличения> числа копий вектора Глава 10. Бакгверии 349 рЛ31010 и к дерепрессии клонируемого в нем гена (рис. 10.10).
В результате синтез белка в пересчете на одну клетку увеличивается на порядок по сравнению с клетками, содержащими только основной вектор. Описанный способ регулирования суперпролукпии незаменим, когда чужеродный белок токсичен для клеток. Существенную проблему при культивировании суперпродуцентов представляет нестабильность рекДНК, сконструированных на базе плазмидных векторов. Эта нестабильность может быль функциональной или структурной.
43 С Г ~ ' Я. о оо , со о ' и оо о сор 30'С о.о оОо ц. -'. о 1 гЯ ° ° '. 'о' ,еу' 1 Рис. 10.10. Схема регулирования еунерпродукпии чужеродного белка е помощью термочувствителыюй системы, состоящей из двух плазмид. о — мультикопийная илазмида рЛЯ1010 с клонируемым геном; о — олигокопийная термочувствитсльная илазмида р1131002, содержащая ген репрессора; в — продукт Первая возникает вследствие нарушений механизма решгикации или распределения векторных ДНК по дочерним клеткам (см. гл. 3).
При этом векторы и рекДНК чаще исклкзчаются из клеток, чем плазмиды, на базе которых они были сконструированы. Например, частота исключения векторов и рекДНК, имеющих Со!Е1 репликон, составляет 10 ' — 10 ' на клетку за олпу ге~~ерацию, а самой плазмиды Со1Е! — менее 1О' . В данном случае причиной нестабильности векторов является их мультимеризация !образование кольцевых димеров, гримеров и тзц) в КесА'-условиях. Она приводит к уменьшению числа репликонов и, как следствие„к увеличен и нз вероятности образования бесплазмидных клеток в процессе деления.
У плазмиды Со!Е1 мультимеризация предотвращается продуктом гена сег (см. рис. 3 12), который отсутствует в векторах, имекипих Со1Е1 репликон. 350 Часть П1. Экспрессия чужеродных генов Суперпродуценты при культивировании быстро вытесншотся бесплазмидными клетками. В лабораторных условиях такие клетки элиминируют путем добавления в культуральну!о среду антибиотиков, если в векторах имеются соответствующие маркеры антибиотикоустойчивости.
Однако это слишком 1!орогой способ, и при промышленном культивировании клеток он непригоден. В биотехнологии применяют другие селективные маркеры или инте!рируют клонируемый ген в клеточную хромосому. Структурная нестабильность рекДНК заклк>чается в том, что в процессе культивирования они могут терять участки нуклеотидной последовательности, в том числе и клонируемый ген.
Клетки с такими химерами делятся быстрее, чем клетки с исходными рекДНК, и в результате "засоряют" популяцию продуцентов. Причины подобной нестабильности молекулярных гибридов многообразны (см. гл. 7) и до конца пе ясны, поэтому уциверсальнык способов борьбы с этим явлением пока не предложено. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОВСУ)КДЕНИЯ 10.!. Как убедиться, что экспрессия клонируемого гена идет не с собственного промотора, а с векторного? 10.2. Прсдложитс схему встраивания целевого гена в вектор рА51 (рис. 10.3,б). 10.3. Предсгавьте поэтапно схему клонирования и экспрессии эукариотического гена и Е соя с помощью вектора рТА1529 (рис.
10.3,г). !0.4. С помощью вслтора )Хоо в клетках Е соя зир' был клониро. ван и экспрессирован ген?аеУ. (рис. 10.5), а (3-галактозидаза выставлена на поверхности фага. Известно, что этот фермент активен в тетрамсрной форме. Почему же он активен в данном случае? 10.5. Какова вероятность того, по при случайной и~ ~тец>ации кД11 К в векторный ген оба гена окажугся в одной рамке счя.гывания? ! 0.6. Какую роль в экспрессиопных фаговых векгорах Хя!11 и е.ХАР играет мутация 5'ч !0.7. Какую роль в генно-инженерной практике играет явление внутриклеточной агрсгации белков' ? 10.8.
Опишите возможности современных экспрсссионных велторов. 10.9. Какие задачи и как можно решать с помощью фагового дисплея? 10.10. В чем нреимушесгво векторов, содержащих двуцистронные экспрсссиопные кассез ы? Дгава П дрожжи Клетки Е. свй К-!2, как уже отмечаггось, являются удобными объектами генно-инженерных экспериментов, имектших конечной целькг структурные исследования клонированных генов и их белков. Ясно, что функциональный анализ большинства эукариотических белков в этой системе затруднен, поскольку многие биологические функции (дифференцировка, митоз, мейоз и т. п.) специфичны только для эукариот.
Поэтому такой анализ следует проводить в зукариотических клетках. Конечно, для анализа растительных или животных белков лучше подходят родственные для них клетки, но в ряде случаев можно использовать более простые для культивирования дрожжевые клетки. Эта возможность основана на том, что клеточная биохимия и механизмы регуляции у высших и низших эукариот очень сходны.
Дрожжевые клетки удобны и как продуценты. В отличие от клеток Е с ой, которые слабо расгут на дешевых субстратах и предрасположены к фаголизису, дрожжи зарекомендовали себя с хорошей стороны при промышленном культивировании, поскольку проявляют высокую генетическую стабильность, не подвергаются фаголизису, не вгдлелягог токсины, растут до высоких плотносгей.
Егпе одно их преимущество заклкгчается в их способности гликозилировать синтезируемые ими белки, чего не могут делать прокариоты. Для клонирования и экспрессии чужеродных генов обычно используют хорошо изученные с генетической точки зрения дрожжи — 5', сегвггвгав (Адашз ег а(, 1993). Эти клетки являются первым эукариотическим организмом, геном которого, состоягггий из 16 хромосом, полностью секвенирован (С)оГГеап ег а1., 1996). Последовательность из ! 2 млн.п.н.
солержит около 6000 генов. В этих клетках лишь в три раза больше ДНК, чем у бактерий. Это 352 Часть Ш. Эквпревсич ну1кергн1ных генов позволяет относителыю легко проволить скрининг клонов, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. В опытах с дрожжевыми и бактериальными клетками выяснилосгь что экспрессия чужеродных генов может быть функциональной и нефункциональной. В случае функциональной экспрессии в отличие от нефункциональной чужеролные белки при подходя!них условиях 1л утуо проявляют свою активность.
В час!ности, некоторые бактериальные белки функционируют в дрожжах, а дрожжевые — в бактериях !табл. 11.!). Таблица !1.1 Гены Я. сегетн!ае, функционально активные в клетках Е. со1! Фермент Ген Я. ссгек Ген-аналог Е. сой Интенсивно разрабатываются системы клонирования у мицеляльных грибов, поскольку они и1рают важную роль как продупенты ферментов и низкомолекулярных веществ в микробиологической промышленности и как патогены в медицине и сельском хозяйстве. Их преимуществом является то, что они секретируют большое количество различных белков и гликозилируют их таким же образом, как и высшие эукариоты.
Клонирование генов в мицеляльных грибах необходимо и для проведения фундаментальных исследований этих организмов. Векторы Для клонирования фрагментов ДНК в дрожжевых клетках используют, как правило, челночные векторы, способные к са- Ай 64 Н2Я Х,Е62 ТКР! ТВР5 1/РА ! !Иг!2 И!АЗ 6А й! агеН ЬВВ !еиВ ггрАВ ирС ругГ! руг В ругр «а!К Аргининосукцииатлиаза Имидазоглицерофосфатдегидротаза В-изопропилмачатдегидрогсназа Трнптофапсинтегаза Индолилглицерофосфатсинтстаза Днгидрооротатдегидрогеназа Аспартат-трапскарбамилаза Оротндин-5'-фосфатдскарбоксилаза Галактокиназа мостоятельной репликации в дрожжах и в клетках Е. со)г'.
Это объясняется, во-первых, тем, что такие векторы позволяют клонировать чужеродные гены в клетках Е. со)г' и затем исследовать их экспресси!о в дрожжевь!х клетках. Во-вторых, из дрожжевых клеток трудно выделить значительное количество векторных молекул, поэтому эту процедуру ведут обычно в два этапа. Сначала из трансформированных дрожжей выделяют суммарнук! ДНК, а затем с ее помощью трансформируют клетки Е сой и по селективным признакам отбирают клоны, содержащие челночные векторы. Выделение же в болыпих количествах векторов и рекДНК из клеток Е со(г' не вызывает затруднений. Табл!!г!а ! !.2 Основные свойства дрожжевых векторов уср Харак4српстика У1р Да Нет Лгпонов4ная рглыикапия Число копий иа клетку Дрожжевой репликатор Другие алсменпа '! астота трансформапии, число колония днк .
!ог кт. '!а<тога кчпеграпии !1отсри при митоае, в % на геиерагопо 1 — 2 АЯ5 СЕЮ 10 — 50 АВ5 Ткь 1 — 2 АВ5 СВЛ', 2ЪГ 25-200 оп, 2 мкм 5ТВ, 2 мкм ! -20 АВ5 ! Нет !о' — !о' !о'-ща 102 104 10 г 104 »1 Переменная ! 1 с<1 »1 при длине <20 ги н с! при длине >50 то и А!го — хромосомный репликатор; СЕЛг — центромерная Д!!К; ТЕ! — теломерная ДНК, 5Т — цецтромсрополобиый сайт 2-микронной плазмиды.
В качестве дрожжевых репликаторов используют хромосомные репликаторы Аг!Ю (см. гл. 5) и гомологичный им репликатор 2-микронной плазмиды (см. рис. 3.18). У дрожжей селективные маркеры типа устойчивости к антибиотикам не обнаружены. Поэтому в качестве таковых стали применять дрожжевые гены, функционально активные и в клетках Е. со(г, т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
