Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Инъецированные в клетки рекомбинантные молекулы ДНК циркуляризуются через сов-сайты и автонолшо реплицируются. В присутствии фага-помощника они могут быть упакованы (л 14ио в фаговые головки и после лизиса клеток отобраны в виде фаговых частиц. Обычно космилы конструируют на базе плазмиды рВК322. Техника клонирования генов с их помощью заключается в следующем.
Космиду линеаризуют рестриктазой через сайт клонирования и 218 Часть 11. Гнилая инженерия сн чн-и чу срод Ар" ' Косыида: ) оп' ' 4сое ' Рсстрикция Рсссриксы Рестрикция 1 Ф с — Мср - -. 1с 21нк- я с 'Г: ~ Уваковкя со мои — — — и~ 1 рно!„РА Р-ЛНК. Рис. 7.9. Схема клопировассия генов с помощью космилы, имеющей олив соя-вайт Направление соя-свита указано черной стрелкой; ~ — сайт рестрикции смешивают ее с чужДН К, подверг нутои частичному гилролизу с помощью рестриктазы, образующей одинаковые липкие концы с вектором.
В резулыате образуются продукты разного строения (рис. 7.9). Из них к упаковке способны только такие фрагменты чужДс1К, которые несут на обоих концах космилы, нахоляпсиеся в одной ориентации. Слеловательно, уже на этапе упаковки осуществляется отбор рекДН К. Реконструированными ш или фагаьи инфицируют бактериальные клетки„а клоны, содержащие рекомбинантные космилы, отбирают по селективным маркерам. При зтоы образуется в срелнем 1О' клонов из 1 мкг чужДН К.
Несмотря на мультикопииносп исходных космил, число копий рекомбинантных космил на клетку це превышает нескольких елинип. Поэтому солержащие их бактериальные клоны необхолимс поллерживать в селективных условиях. Глава 7 Векторы для кяокирониния е бактериях 2! 9 Главные преимущества космил: 1) передача рекДН К в клетки инфипированием гораздо эффектиш1се, чем трансформациеи; 2) в инфицированные клетки проникают в основном рекомбинацтные молекулы ДНК; 3) происходит селекция больших клонируемых фрагментов (30 — 45 т.п.н.), в то время как цри трансформации отбираются главным образом плазмилы меныпего размера.
Последнее особеппо важно при создании банка генов и при необходимости клонировать и анализировать эукариотические гены больших размеров. Однако космидам присущи и серьезные недостатки. Первый— возможность объединения в одной рекомбинантной космиле двух или более фрагментов чужДНК, не располагающихся рядом в исходном геноме, что затрудняет правильную интерпретацию выводов о структуре генов.
Во избежание этого перед клонированием необходимо дефосфорилировать фрагменты ~ужДНК и/или спобрать фракцию размером 30 — 45 т.п,н. Первый способ леласт невозможным объелинение фрагмен гов ДНК друг с другом (см. гл. 8), а второй препятствует упаковке слишком больших рекомбинантных космил. Другой недостаток — нестабильность рекомбинантных космид, причем пну 1римолскулярцые лелеции образуются даже в гесА- щтаммах. Он устраняется использованием клеток Е. сод гесВСяЬсВгес). Наконец, наблюлается сравнительно высокий фон мультимерных векгорных молекул, которыи затрулняет поиск рекомбинантных клопов. И в этом случае рекомендуется дефосфорилировать линеаризованные космилы, что предотвратит их объединение. Но как, однако, лигировагь вектор и чужДН К, если оба компонентадефосфорилированы3 Наиболее просто эта проблема решается при использовании космиды с двумя олинаково ориентированными соя-сайтами с2КВ (Вагеьх Вуе)ГК 1983).
В реакции лигирования с чужДНК участвуют лва разных фрагмента космилы, полученных в результате ее расщепления через единичнгяе сайты Вот1 Н и Ята( (рис. 7.10). Первый сайт предназначен для клонирования ~ еномной ДН К, частично гтщролизованной рессриктазой 5аи3А и подвергнутой лейс«пик~ щелочной фосфатазы, Расположенный между соя-сайтами сайт Лгла1, образуя ровные концы, препятсгвуег мулыимеризапии космид, так как такие концы с трудом объелиняются друг с другом (чтобы исключить обьединение ровных концов космидной ДНК, образованнслх 220 Часть Н. Гснлггп илзкелерпя ьл пг!го рес!риктазой Жла1„реакцию с ДНК-лигазой фага Т4 велут при высокой концентрации АТР— 2,5 мМ).
Далее в головку фага 2. упаковывают рекДНК. 11ри этом ген Кл!к теряется из-за "разрезания"' ДНК по соя-сайтам, в связи с чем отбор инфицированных клеток идет по маркеру Арк. Два Есор-сайта, фланкируюшие Вал!Н1-сайт, необходимы при использовании вектора для "прогулок по хромосоме"'1сы. гл. 9). МСЯ. "ЕВВСН Чужородвая Йнк | Яапзл Гцокоопая фоофкппа Гпва! ~в н! ; Япп! Ягпа1 „ ййв =пе Ялга! воза! оп Ягоа1 Рохйнх Упаковка зп го!го РокДНК в головко фага Х Рис. 7 10.
Схема клонирования генов е помо!нью космиды с2КВ„нме!ошег! лва спз-сайта. Са!Ны рестрикции.  — 11аглН1, Š— ЕсоИ, Н вЂ” 1!и!с!Н1, С вЂ” Сгп1. Направление сок-сайта указано черной стрелкой Современные космиды имеют полилинкеры„по краям которых расположены сайты лля релкощепящих рестриктаз с целью "вырезания" клонированных фрагментов, или фаговые промото- Глава 7.
Векторы для емояорооояия в бокя~ериях 22 ! ры с цсльк> получения транскриитов с концсвых участков вставок. '1 ранскрипты используют в качсстнс зондов в мстодс "прогулки по хромосомс'* (см. гл. 9). Сконструированы также космнды, содсржащис эукариотичсскис оп'-сайты и сслсктивныс маркеры; они прсдназначсны для работы с клстками животных (сль гл. 13).
Отмсгим, однако, что в связи с тсхиичсскими трудностями космиды применяют всс реже. Фазмиды. О природных фазмидах, сочстаквщих в себс свойства фагов и плазмид, уже упоминалось в гл. 4. В фазмидиых вскторах искусно сочетаются положитсльныс свойства фаговых и илазмидных векторов. Один из псрвых таких вскторов — фазмида ЛрМ'т'Е! 31 (Янковский и др., 1987). Лсвос плсчо этой фазмиды происходит от вектора 147. 1Ааш Ваш, иранос — от всктора Лв! !тЕБ, а мсжду ними всгросна плазмила рНС19, линеаризованная через ВатН1-сайт, находящийся в полилииксрс (см. рис. 7.7).
Размср фазмиды (33,3 т.п.н.) нс лопускаст сс упаковки в головку фага Л, поэтому для наработки векторной ДНК используют плазмидный рспликатор, а само это свойство примсияют для отбора рскомбинантиых фазмид в виде фаговых частиц, рскоиструированных о~ тйго.
Емкость вектора ЛрМУЕ!31 — 4,4 — 19,6 тльн., что позволяст привлекать сто для получения банков гонов. Выход рскДНК лостигаст 3 к !0' фаговых клонов на 1 мкг вскториой ДНК. Рскомбинантные фазмиды можно отбирать и в составс бактсриальных клопов, инфицируя ими Л-лизогсны и отбирая транслукганты на срелс с ампициллином. Фазмидцыс некторы так жс как и фаговыс, используют для клонирования кДНК и гсиомиой ДНК. Эффективность упаковки рскомбииаш иых фазмид в фаговую головку с последу!ощиы инфицироваиием клеток Е соВ превосходит эффсктивность трансформации бактерий плазмидами в !00 раз. Это существенно облсгчаст конструирование банков ~ шюв, содсржащих до миллиона независимых клонов, повышая тсм самым всроятносгь изолирования рсдких клонов.
И сам процесс скрининга в данном случас также существенно обло> чсн, так как расссв фагов на ишки можст проводиться с высокой плотностью, а фон "ложных ответов" обычно мал (см. гл. 9). Однако большой размср фаговых и фазмидиых вскторов затрудняст рсстрикциоииый анализ клониронанных генов и их ссквенироваиис, так что после иахождсния 222 ь1асть 1!. Генная нпженерин !и пгш нужного клона вставку, как правило, переносят в плазмиднгай вектор. Эта процелура методами ьч 1нгго отнимает много времени. От нсе избавляет оригинальный фазмидный вектор ЛИАР (Язеп ег а(., 1988), который обладает уникалыюй способностью исключатып пю содсржаьцук>ся в нем плазмиду вместе с клонированными генами.
Вектор ЛУЛР (рис. 7.7) разработан и выпускается фирмой "Стратаген". Он используется главным образом для ююнирования и экспрессии кДНК. Его сердцевина — фапиила рВ!исвспр! ЬК(-), сконструированная на базе фагы яды рЕМ ВЕ8 и плазм иды рОС! 9 (рис. 7 4а). Из этих нлазмид были вззпы сслсктивные маркеры Ар"' и !асХ', при~ем во второй бьщ ннсдрс~ ~ полилинкер, фланкированный противоположно ориентированными промозорами фатов ТЗ и 'Р7. Они прсдназначс~ ~ы д.ш получения трап скриптов кло~ ~ирован~ ~ых генов с любой нити.
В составе вектора ЛХЛР фагмида рВ!везсг1р! М! ЗКК(--) ограниюна сайтами инициапии и терминапни репликации ДНК фага П, которые расположены в шу-сайте и перекрываются в нем. Благодаря им в присугсгвии фага (1 (+)-нить фагмиды вместе с клонированным геном вытесняется из Д1!К вектора ЛУАР с помощью белка яр(1, начиная с сайта инипиации репликации и кончая сайтом терминапин. Далее вьпсснснная нить циркуляризуегся и после нескольких раунлов репликации упаковывается в фаговые белки. Инфицирован ис репипис~ ~тных клеток сформировавшимися фаговыми частицами позволяет отобрать на сслекзивных средах клоны, содержащие рекомбинантныс фагмилы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
