Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 37
Текст из файла (страница 37)
1йюгда фаговыс рскДН К можно селсктив~ю отбирать в составе частиц. г!дагомыс векторы позволяют клонировать гены, продукты которых токсичны для клетки, так как опи нс оказывают вредного действия на фаг. 1!аконец, фаговыс векторы и фаговые рекДН К относительно де~ ко выделяются из клеток без примеси бактериальной ДНК, поскольку при этом они находятся в составе фаз овых частиц. СИС!'КМЫ КЛОИИРОВЛПИЯ В КЛВРГКАХ Е. кол Илазмидные векторы.
Первые плазмидные векторы рБС101 (СоЬсп гч а!., 1973) и Со! Гт! (НегвЬбе!с! ет а1., 1974) прсдставпяют интерес лишь с исторической точки зрения. Они оба нссуз но одному сайту узнавания для рсстриктазы ЕсоК! и использовались лля клонирования ЕсоК!-фрагментов ДНК. С этой целью кольцевыс вскторныс молекулы сначала линеаризовали рестриктазой, в результате чего образовывались 5'-льву| ~ающие однонитевые концы 5'-ЛА ГТ-3'. Такис жс концы имелись и у фрагментов чужДНК, по позволяло объединять эти молекулы благодаря их комплемснтарным взаилюдействиям и восстанавливать ковалентные связи с помощью ДН К-лигазы (рис. 7.1). Отмст им, кстати, что одновременно было предложено сигпезировать комплсментарные кон~ !ы у взаимодействующих молекул фсрментативными методами (1 оЬЬап, Ка(зсг, 1973; см.
гл. 8). Эти процедуры получения рекДНК стали с тех пор классическими, ознаменовав ~ ~ачало истории генетической инженерии. 194 Ч»счь 1!. Гннная ннженерня нн илн !мни Еаоя! Еаыц ю в! в- а! Чунарил»аа днК дик - нагана 1 Илош !в В! Т а тгг '! тнл ттлл 'плл Рис. 7.!. Образование рскомбинантпой молекулы ДНК с помощью рестриктазы Есой! и ДНК-лигазы 17яазмиди рЮС101. Ес размер 9,1 т п,н. Она низкокопийна и содержит ген устоичивости к тетрациклину. При разрезании ее рестриктазой ЕсоК( репликативцыс гены и детерминанта устойчивости к антибиотику нс затрагиваются.
Поэтому трансформанты с плазмидой отыскиванзт по селективному маркеру. Однако найти среди них клетки с рекДНК можно только при наличии в клонируемом гене селекгивных свойств, что является недостатком этого вектора. С его по»!огц! ю были впервые осуществлены в клетках Е со(! экспрессия чужеродного гена (гена Ар» плазмиды р!258 золотистого стафилококка; СЬапт1, Со)!еп, 1974) и клонирование эукариотичсской ДН К (гена рибосомной РНК из ооцитов цшорпевой лягушки; Моггоч е! а!., !974). Во втором случае клоны с рекДНК были выявлены рсстрикционным анализом плазмид, выделенных из трансформантов.
Область использования вектора рЯ.!И и его произволпых (как, собственно, и других малокопийных векторов) — это клонирование таких генов, продукты которых в большом количестве приводят к серьезным нарушениям нормального клеточного метаболизма. 11яазлаида Со1Е1. Э!а плазмида оказалась более удобной. Она, во-первых,мультикопийна, причем инкубация клеток в присутствии ингибиторов синтеза белка (хлорамфсникол, спекти>юми- Глава 7.
Векторы для клонрдооония е Вокв!ернях !95 пин и лр.) доводит число ес копий на клетку до 3000 (см. гл. 3) Это позволяет выделять из 1 л культуры клеток до 1 мг плазмилной ДН К, Во-вторых, клонируемый с ес помощью фрагмент„интегрируясь в Со1Е! ДНК через ЕсоИ-сайт в гснс сеа, нарушает синтез колицина (см. рис. 3.!2). Бактериальпые клегки, трансформированные этой плазмидой, распознают по устойчивости к колицину, обусловленной геном Влт, а клоны с рекДНК отличают по отсутсгвию в них синтеза колицина. Сс!Е! ИШП (, ),р О~ к1бгдГ9 ~ з Р~РкпР Арп ~ ввЫГМ ' и и, ч™~.. Ар т З ~Арп рВа212 ~ ( ) Ь Ар" Тс, + ( рВВЗ12 )пып Ар Тс~ Я,' ! рВВЗР22 ', ( Ар'т ' рмвз !Ь Ар" ! Явсса!" рма9 !ппп Тс б ~ Тс Ессае раС1О1 рмвв !ппс Тс рвазтб ! 1Ар"ГспС и~ Р отп Рис.
7.2. Схема создания вскп1ра рВк322. Π— геном использован 11елпостбвкег — геном использован частично; Внт — иммунитет к колиципу Однако и плазмила Со(И пс нашла широкого применения в качестве вектора, так как ее признак иммунитета является плохим селсктивным маркером. Погпому в последующие годы на ее 196 Часть И. ленная нннеенерня Гп ива основе, а также на базе ренликонов мультикопииных природны: плазмид — рМВ1 (родственна плазмилс Со! Е! и несовместима ~ ней) и Р15А (совместима с Со!Е1) были сконструированы произ водные векторы, солсржащие высокосслсктивные маркеры устойчивости к антибиотикам других плазмид. Примером подобноп консз руирования можс.г служип, схема созлания многоцслевогг вектора рВК322 (рис.
7.2; Во!веаг ег аl., 1977а,Ь), до сих пор широ ко используемого в лабораторной практике. Вектор рВВ322. Этот вектор (рис. 7.3) ссквспирован, в нсн 4361 п.н. Он содержгп рспликатор плазмилы рМВ1 и сохраняет оа нее свойство мультикопийности (15 — 20 копий на клетку) и способность к амплификации в присутствии хлорамфеникола.
Оа плазмиды рВС10! ~срез плазмиду рМВ9 ему перепав признак ус тоичивости к тетрациклину, а от плазмиды КЫпН9, солержащс) транспозон Тп3, через плазмиду КВГ2124 — к ампициллину. Наличие в векторе лвух детерминант устойчивости к антибиотикам солержащих несколько единственных саитов рестрикции, значительно расширяе! его возможности при клонировании генов. Этс позволяет вести о~бор трансформантов по их устойчивости к олному антибиотику, а клоны с рскДНК выявлять после перепечатки трансформантов на соответствую!лис ~яшки по их чувсз вительносги к лругому антибиотику.
Для экспсрвме1пов с внедрением чужДНК в ~сн Ар" разработан метод прямой селекции Ар'-клеток. чувствительных к ампициллину. Он ос!юван на том, !то р-лактамаза, колирусмая зрим геном, превращает псницшшин в пеницилловую кислоту, козорая с!юсобна связывап йод. Трансформанты отбиракп. на срслс, содержащей тетрацикл ин и крахмал. Затем выросшие колонии опрыскивают раствором, содержащим пенициллин и йол, при этом Арн-колонии обесцвсчивают инпикаторный раствор, а Арн-колонии — нс обесцвечивают. Отметим важность наличия сайтов каонирования в промоторе гена Теа (рис. 7.3). Внецрснис чужДНК в П)пгЛН-сайт инактивируст промотор и делает трансформанты чувствительными к тстраци клину.
Это обе )оятельство используют для поиска фрагментов ДНК, содержащих промотор-подобные структуры. Трансформанты с такими рскДНК сохраняют устойчивость к ~етрациклиг!у. Глава 7, Векторы Воя клонирования в бактериях 197 СЫ 23 Ч 185 ЫЬе! 229 Выпи! 375 вры 562 Есои! 622 за1! 651 — ХПИ1П 939 Нсо! 972 Вары! ! 063 3844 3733 Р 3607 Рв 3537 Аае 3433 Рра Рвв)! 2061 4 -Деветвроваво в РАтп 53 — И Рис. 7.3. впизичсская карта вектора РВК322. Указаны едипствешпяе сайты рестрикции, находящиеся в генах Ар" и 7е". Координаты отсчитыва!ется от сайта Ееорс! Плазмида рВВ322 достаточно стабильна: культивирование клеток Е.
со(1, содержащих эту плазмиду, в отсутствие антибиотика в течение 30 генераций нс приво!(ит к се значительной 11отсрс Это дает возможность использовать ес в прикладных целях„поскольку масштабные фермсптации обычно не превьппа!от 3() клезо шых генераций Имсклпийся в векторе рВК322 локус Ьот (ог!Г) делает его потенциально способным к мобилизации, но локус !лоЬ, нсобходимь1й для этого (см. п1. 3), в нем отсутствует. Мобилизация вектора конъ1огативными плазмилами возможна в присутствии совместимой плазмиды Со)К, обладаьэщсй юмологичпым локусом л1оЬ. Следует отмстить снижен!ие стабильности этого вектора в 7ееА" клетках, поскольку в нем также нет локуса гбк На основе 1щазмиды рВК322 сконструировано много производных векторов разнообразного назначения (экспрессия генов и секреция белков, прямая селекция рскДНК, Идентификация ре!.уляторных си~палов и т.
д.). При вкл!очении в цлазмиду рВК322 маркера устойчивости к хлорамфениколу Ст", взятою из транспозона Тп9 фага Р! Ст, образовался вектор рВК325 (см. рис. 7.2). В гснс Сл!а этого вектора имеется сайт клонирования Есой(, что очень удобно ввиду доступности рестрикзазы ЕсоИ. Вектор рттТ)53 получен 198 Часть И. /еялая инженерия ея наго лслстиронанисм участка ДН К илазмилы рВК322, в котором находятся сайт Ьоел и локус с гсном гор, контролирую1пим число копий плазмидных молскул (см. рис, 7.3).
Поэтому илазмида рЛТ153 нс мобилизуется, а число сс копий н клетке значитслыю болыис, чем у' рВК322 (Тнт88, Вйсггап, 1980). Длина генома рЛТ153 сос~анляст около 80 % тщины рВК322. //екторы,о//С. Широкое распространснис получили векторы серии р(!С (рис. 7.4,и). Они были сконструированы влабораюрии Мсссинга (Уап)н!1-Рсггоп ег а/., 1985) и прсдназна ясны для клонирования и экспрессии гонов. Коиийность этих нскторон дости~аст 500 на клс псу. Их удобство заключастся в том, что сслсктивным признаком для отличия вектора от рскДНК служит ).ас-фсиотии рсциииситных клеток.
Основа векторов р13С вЂ” часть плазмиды рВК322, содержащая оп-сайт и гсн Ар", а их "изюмииа" — экспрсссиоиныс кассеты, взятыс из одноиитсных векторов М13тр (см. с. 214). Номера р(ЗС- и М ! З~пр-нскторон совпалают, если касссты одинаконы (см. рис. 7.4). Зкспрсссиониой кассетой иазывак1т блок рс~уляториых последонатсльностсй, обссисчинающих транскрипцию клонирусмых генон. В нскторах М13тр и рНС в эту касссту входят регуляторная часть /ас-опсрона (н том числе и гснрспрсссор /аг1) и начальная часть гона /асХ (локус /асХ'), кодирующая так назьпгасмый а-псптид !З-галактозидазы, состоящий из 145 аминокислот.
Этот исптнд способен комплсмснтировать /л н/ходсфск~ ный бактсриальный белок В-галактозидазу, у которой отсугстнукп аминокислоты с одиннадцатой ио сорок псрвую в Х-коипеной части (дслсция /асУЛМ15; О!!шапп, Рсгг!п, 1970). В рсзультатс трансформация плазмидой р()С клсток, имсющих части шую лслспию начальной части гена /ас7, приводит к измснсищо их фсиотииа от (.ас к (.ас ' (эффскт гх-комплсмснтации).
Для создания н локусс /ас7'сайта клонирования н нсм был сначала образован ЕсоК1-сайт. С этой цслыо методом локализованного мутагснсза (см. гл. 8) н 5-м кодонс ~уанин был замснсн адснином. 4 5 6 аоК1 АСС:САТ:ТСА — > АССйЛЛТ:ТСЛ, что принсло к смсне аспартата на аспарагин н а-исптилс, но нс нарушило ого комплемситационную активность. В образонанший- Глава 7. Векторы доя клонирования о бактериях 199 ся сайт можно вводить полилинкеры с числом нуклсотиЛных пар, кратным трем.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
