Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Репликацня векторов зависит от клеточных белков, поэтому лля каждого вида реципиентных клеток необхолимо конструнрова.гь свои векторы. 11аиболее полходпцие кандидаты на роль векторов — естественные репликоны небольших размеров: ДНК нлазмил и вирусов (в том числе и фагов), но непосредственно в этом качестве их используют релко.
Обычно их прелварительно молифицируют или комбинируют их части лля того, чтобы они отвечали опрелеленным требованиям. Самые распространенные плазмилные векторы клеток Е. сей — плазмила рВК322 и ее специализировщгпые производные. Для этих же клеток сконструированы Фа~овые векторы на основе ДНК Фага ). и нитевидных Фагов. Разработаны векторы (космилы), позвощпощие отбирать рекЛНК путем их упаковки ьч иуго в головки фага 7 . Создаются векторы 1»ава 7. Векторы д»» к»о»орава»а» в лак»перо»л 189 и Лля промышленных микроорганизмов — бактерий (Вас(1/игв !йеиг/стопа»„Еггерготусе» и тэь) и низших грибов (Бассбаготусех, .4грег»11/ггь; /теигое/юга и г. л.). Интенсивно илет работа ио конструированию новых векторов для переноса генов в растительные и животные клетки.
Напомним, что любая система клонирования состоит из двух взаимно связанных компонентов — векторов и реципиентных клеток, и также, из методов переноса первых во вторые. Плазмидные векторы вволя г в рецнпие!иные клетки трансформацией — кальпиевым метолом или электроиорацией, а фаговые — иифипированием или траисфею1ией.
1Птаммы Е. соВ К-12, наиболее часто используемые в качестве реципиеитиых клеток, перечислены в табл. 7.1. Характерная особенность этих клеток — наличие у иих мутаций МЯ или ЬсБ, прелохраняюгцих клоиируемые фрапиенты от лействия рестриктазы ЕсоК. Таблица 7.1 Штаммы Е. соВ К-12, используемые лля ~ение-инженерных манивуляний Комментарии Генотип Содержит ген РНК-полимера- зы Т7. Экспрессия генов, ио- сив,|сивых ~юл нромотор рТ7. Высокий уровень трансфор- мации. Ос»лсстигяст секо«в пементмгию нри работе с векторами рОС.
а1 12с1га857 тг/1 Ваш7 ас(Л'5-Т7 вспс 1) 0 гесА! 3 «ирЕ44 ага-! 4 1асУ!8а/К 2 грй.20 «у1-5 1 гесС22 вбей!5 Ь(1ас -рго)/ГггаОЗб "' 1ас!ч ЬМ15 7 епг1А1 гесА! хугА9б 44 ге/А! 11»-1 7 епВЛ! гегА! хугЛ96 44 ге/А! Гбн1 Л/асБ)б9 !ас2ЛМ!5) Л(егт, lсггЯМБ, гпсгВС) 4 ггеоК ЯОО/асХАМ)5 ага 1) 13 У ха1 (/ха12Г а(и га, 79 Х Лж).
епггЛ1 пврБ ВАС-клонирование, высокая частота элсктроиорагши кле- ток Фрагментами Д11К ло 300 т.п.н. Осуществляет а-кол~илементаиию. й-М- лля систем ЕсоК и ЕсоВ. Высокий уровень трансфор- маиии. Клонирование протяженных инвертированных повторов. Клонирование векторов се- рии М!Зглр.
Окончание ~лабл. 7.1 Штамм 1'енотип Коммента ий К802 1.ЕЗ92 Ы2-1 )с)М538 1ч М 539 8 К288! БМК!О' 1мг1В 4 гесА! спи гбсВ15 ХБ101 Х5!27 Манипуляции с фагмпдами. Манил)осяции с фагмидамя и сс-комплементация. * Штамм В этой главе описыва!огся только прокариотические векторы об!него назначения, позволяющие проводить клонирование чужДНК, Олнако, как правило, клонирование ДН К осуществляют с какои-то определеш юй целью (экспрессия генов, секреция белков, ицсерциош~ый мугагенез, поиск промоторов, поиск терминаторов транскрипции и т.п.) и для ее дос.псжения обычно применя!от специализированные векторы.
Эти векторы, а также векторы, предназначенные для работы с эукариотическими клетками, по мере необходимости будут рассмотрены в последу!ощсих главах. ОБ!ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕК!ОРОВ Класси(бгекаяи». Ее можно провести по разным признакам. По области использования различасот: 1) векторы общего назначения (клонирование геномных генов, кДНК, щобых фрагмен- товДНК), 2) векторы дтя экспрессии клонированных генов (синтез мРНК и белков) и 3) специализированные векторы (секвенирование и мугирование генов, изучение особенностей регуляции клонированных генов, идентификация в клоцируемой ДНК про- 190 Часть Н. Генная иссчсенерил т ила сирЕ 1ссч)й ли1 тегВ 1иЖ5 ! 4 лир Е44 еирГ58 8а)К2 каЛ 22 те!В орр.55 1асу! ли!К А8(Л о1с)ьВ агп)чс)чез с! га857 ЬН1) Ьи с)о Ьт )Ч г карр ЬЫК ирй ЛасУ лирГ Ьст% щй 1асУ (Р2сох) (Лсол2 А!3 хй! гег)3 латапс210 с11»857 та5 5асл7)Лв гесА! Ьсглс гроВЗЗ)|Р'(Ьан) 8)тА 11с1 гРоВЗЗ ! А(1ас— рго)/Г гги!336 ргоАВ' 1ас!л АМ!5 Е со!с С.
Манипуляции с Л векторалссь Клонирование космил и Л векторов. Экспрессия клонирусмых ге- нов с цромотора Лр1 . Манипуляции с Л векторами. Отбор Л рекД1!К по Брг-фе- нотипу. Высокий уровень трансфор- мации. Упаковка Л Д1!К 1н Иао. Глава 7. Векторы дяя кяоннроооння н бокгнернях 191 моторов и других регуляторных сайтов). 1!о п р о и с х о ж д е н и ю ДНК векторы делят на: 1) плазмидныс (существуют в клетке и вне ее только в виде молекул ДНК), 2) фаговыс (существуют в виде молекул ДНК и вирионов) и 3) гибридные (сочетают отдельные свойства плазмил и фагов).
По отру кт.уре Д Н К различают кольцсвыс и линейные векторы. По способу поддержания в к л е т к е вьщеляюп ! ) авгономнгае (реплицируклся самостоятельно) и 2) интегративные (рсплицируются в составе клеточной хромосомы) векторы. По ~пслу молекул в клетке векторы могут быть: 1) малокопийными (несколько копий) и 2) мультикопийными (лесятки копий). Поч и ел у рспл и каторов, имсюгцихсяввекторном геноме, векторы делят на: 1) моно- и 2) бирепликонные (бирспликонныс векторы называют также чслпочнылщ, если они могут рсплицироваться в клетках различных видов).
Оеноаньге свойства. Для эффективного выл юлнения своей функции вектор должен отвечать определенным требованиям: 1) быть рспликоном, чтобы стабильно существовать в клетке; 2) иметь селективный маркер, гюзволяющий озбирагь трансформированные вектором к;|стки; 3) иметь, по крайней мере, один единичный сайт рестрикции для внедрения в него чужДНК (подобные сайты будем в дальнейшем называть сайтами клонирования). Эти требования, конечно, пе жссткис. Например, оп'-сайты могут отсутствовать в интегративных векторах, а селективпыс маркеры — в фаговых.
Доаолннгаельные свойсгава. Они определяются целью клонирования генов. Поэтому болыпинство векторов носит специализированный характер, т. е. их приспосабливают лля рсшс~ ~ив узкого круга задач. Например, векторы, предназначенныс для экспрессии генов„содержат около сайтов клонирования мощныс промоторы, причем экспрессия може~ быть регулируемой или нере~улируемой (конститутивной).
Присутствие в таких иск~орах специальных сигнальных последовательностей обеспечивает секрецию продуктов клонирусмых генов. Малокопийные векторы позволяют изучать, например, механизмы рег уляции клонирусмых генов, а мультикопийные способны умножать (амплифицировать) их число в сотни и тысячи раз. Разработаны векторы для секвснирования нуклеотилных последовательностей и для поиска в них определенных регуляторных сигналов — промоторов, терминаторов транскрипции, !92 Часть !!. (еннан ннлкенернн нн и1гн аьпнтсрминатороа и т. л.
Векторы прямой селекции позволяют выживать только таким тра! 1сформаьпам, которыс соясржат рскДН К. Сконструированы Вскторы, имсющис широкий круг клеток-рсциписнтоя. Имс1отся чсл1 1о и 1ыс векторы, способные рсплицироваться В клстках, относящихся лаже к разным царстнам. !)скторы, как прааило, создают.1т1кими, чтобы они могли нарабатываться в прспаратинных количсствах. Это лостигастся использованием при их конструироаании рспликаторов мультикопийных плазмил или фагов с высокой пролуктианостыо (фаг ). и нитсяилныс фаги), пОЗВОля10щих ВОлучать От нсскОльких лссгпкОВ ЛО 1ыс5!чи Вск!орных молскул на клстку. Важно также предусмотреть В конструкции Всктора возможность лс! кого вычленения ('"вырсза11ия"') клонирусмых гспов.
Плазмнды или фиги? Выбор Всктора — плазмнлно!о или фа- 1ОВО!Π— ОНРСЛСЛ51СТСЯ ЦСЛЫО КЛОНИРОВЫ1ИЯ И УСЛОВИЯМИ ГСННО- инжснсрно1о эксперимента. Размер плазмилных Век!оров, как правило, нсвслик — несколько тысяч нар нуклсотиЛов. !! рсимуп!Сства плазмна нсбольшого размера: 1) их карты рсстрикцни отлюситслыю просты, что УВСЛИЧИВВСт ВСРОЯни1ОСтЬ НаЛИЧИЯ В НИХ СДИНИЧНЫХ СайтОВ УЗНавания лля конкрстных рсс!рикзаз и знач!псльно облсгчаст состаялснис полобных кар.г у клонирусмых фрагментов; 2) такие молскулы ДНК болсс устойчивы к 1юврсжасниям при манипулировании ими 1Л 15!!го; 3) они, как прааило, мультикопийны; 4) имсстся большая Всроят>юсть обнаружения рскДНК с помощью радиоактивных зондов В пропсдурс скринигна мстолом гибрилизации (см, гл.
9), поскольку с повышснисм размера плазмил умсньшастся их копийност!ь что ослабляст сигнал лстскции. !1о этим причинам плазмилныс Вскторь! использую! лля клонироаания нсбольших фра!мсптов ДНК (размср рскДНК обыч1ю нс превышает 10 — ! 5 т.п.н.). Однако с умсньшснисм длины Вск1орных молскул снижается число уникальных сайтов, используемых лля клонирояания генов.
С целью устранс1 !ия это!о дефекта В плазмияы Вводят полилинксры, т. с. си1ггс гичсскис олигонуклсотилы, солсржашис ло десятка и болсс различных сай.гов клонирования (их обознача1от МСВ— пшййр!с С1опйз!3 з)5сх). Эти сайты мо1.ут быть использованы каждый по отдельности или В любой комби! 1ации, давал возможность Глава 7. Волторн Вия кяояироооиия о локтория» !93 низ сгрировать фрагменты чужДНК, полученные с помощью раз ых рсстрик газ, в зада~ пюй ориентации. Более то1 о, такис фрагменты можно "вырсзатья по соседним сайтам, что увеличивает возможности манипулирования генами и их физического картирования (см. гл.
8). 1! ряде случаев нрсдпочппсльнее использовать фаговыс векторы. Эти вскторы конструирунэт на базе ДНК фагов с таким расчетом, чтобы в них сохранилась информация, которая обес~ ~сминает сборку ш г1ио фаговых частиц, и чтобы имелась возможность упаковать рекДНК в фаговые ~оловки. Фаговые векторы обладакп следующими особенностями. Нскоторыс такис векторы и рск11НК, сконструированные на их основе, можно упаковать!п г11го в капсиды, что значительно увеличивает эффективное~и их введения в рсцинисн~ные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
