Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 31
Текст из файла (страница 31)
В генно-инженерных экспериментах репнине~нные клетки играют двойную роль. На первом этапе после манипуляций с молекулами ДНК т ий'о они служат для их клонирования, т. е. для разделения смеси всевозможных продуктов реакции по отдельным клеткам и получения клонов, содержащих векторы или индивидуальные рскДН К. Именно поэтому всю процедуру называют "клонирование ДНК" или "клонирование генов". На последуюших этапах реципиентные клетки используют для амнлификации клонированных генов„для получения их продуктов и т. д.
Методы клонирования генов исключительно важны для фундаментальных исследований и прикладных целей. Они носят 162 Часть П. Генная инженерия нн игео универсальный характер, а системы клонирования приходится разрабатывать для каждого из видов организмов индивидуально. В понятие "системы клонирования'* для определенного вида входят набор векторов, способных реплицироваться в клетках данного организма, подходящие реципиентные клетки, а также способы переноса в них векторов и рекДНК.
Из современных пособий по лабораторной генно-инженерной практике отметим прежде всего четырехтомное издание "Оепогпе апа1уяз*' (1997 — 1998): т. 1 — "Анализ ДН К*', т. 2 — "Определение генов", т. 3 — "Системы клонирования", т. 4 — "Картирование геномов*'. Ряд новых методов описан в "Оспе с1оп)пя апд апа1уз1ге Сцггепг шпс напои" (1997). Некоторые из этих методов в действии живо и интересно изложены в лекциях, прочитанных Е.Д. Свердловым в МГУ им. М.В. Ломоносова (Свердлов, 1995 — 1998).
Глава б ФЕРМЕНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ К наиболее важным ферментам, применяющимся в генетической инженерии, относятся специфические э~ щонуклеазы — рестрикз азы, с помощью которых получают фрагменты ДН К воспроизводимого состава и длины, а также ДНК-лигазы, объединяюгцие эти фрагменты. Широко применяются также различные ДНК-полимеразы, ведущие матричный синтез ДНК. Среди них уникальный фермент — обратная транскриптаза, которая синтезирует копии гснов„используя в качестве матрицы их мРНК. Ферменты рестрикции и модификации Рестриктазы. О явлении рестрикции и модификации у бактерий уже упоминалось в гл.
5. В частности подчеркивалось, что специальныс ферменты — рестриктазы — узнают в ДНК определенныс специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и расщепляют ее, если она не модифицирована в этих же участках сайт-специфическими метилазами. Уже описано около 2500 рестриктаз, выделенных из разных микроорганизмов. Рсстриктазы и мегилазы обозначакпся буквами К и М.
Название фермента складывается из первой буквы рода бактерий и двух первых букв вида, например Застив вдбл!и — Вви, ЕьсйепсЬа соВ— гсо. Нри необходимости дается типовая характеристика штамма: к примеру, тплс обозначает фермент из клеток НаеглорЬйа шВнелгае с серотипом с. Если в определенном штамме клеток имеется несколько систем рестрикции и модификации (КМ-систем), то вводится дополнительно числовое обозначение. Так, названия Нав1, ЫавП и НаеП! относятся к трем разным ферментам клеток ОавглорЬЬв аеятрлы. Белки КМ-систем могут кодироваться плазмидами и фагами, и тогда к названию фермента добавляется !64 Часть П, 1енная инженерия еа едео название внехромосомного элемента. Например, название ЕсоР! относится к ферменту, кодируемому фатом Р1.
С учетом основных свойств КМ-систем 1субъединичность строения, потребность в кофакторах, специфичность сайтов расщепления и их положение относительно сайтов узнавания) их подразделяют на четыре класса. Потребность в ионах Мя-'" характерна для всех рестриктаз, а для работы ферментов классов 1, Ш и Г~/, кроме того, обязательно присутствие в среде АТР и б-аденозилметионина. Рестриктазы класса 1 растцепляютДНКв произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотилов от са!пов узнавания, образуя при этом сплошной спектр рестрик гов.
Поэтому эти рестриктазы в генетической инженерии практически не используют„так как с их помощью нельзя получить фрагменты ДН К, строго детерминированные по размерам и содержанию информации. Тем не менее, знакомство с КМ-системами штаммов Е со1Ь относящимися к классу 1, необходимо ввиду того, что именно в этих клетках (главным образом штамма К-12) ведуг тссгирование чужДНК. Их рсстриктазы и метилазы объединены в один комплекс с белком $, обеспечиваогдим связь всего комплекса с сайтом узнавания, если сайт не метилирован. Как и все сайты узнавания ферментов этого класса, ЕсоК-сайт несимметричен: 5'-ААСХХй1Х)Ч)х10ТГ3С-3' 3'-ТТГЗЫг11ч й!Х)х!САСП-5' (краткая запись — 5'-ААСй1еПТОС-3').
Какие факторы предопределяют место расщепления ДНК К-субъединицей, остается пока неясным, но известно, что в процессе гидролиза комплекс К,М,Я остается связанным с сайтом узнавания. Субъединицы комплекса кодируются генами Ьзе1К, ЬЫМ и Ьяеб. С целью предотвращения деградации чужДНК ее вводят, как правило, только в клетки, мутантные по гену ЬЫК.
У рестриктаз класса 11 сайтырасщепления совпадают с сайтами узнавания или находятся рядом с ними на строго определенном расстоянии, что позволяет получать рестрикты определенной длины. Кроме того, рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо, что весьма удобно в экспериментальном плане. Поэтому они широко применяются для генетического конструирования 1л игео, выделения генов, их физического картиро- Глава б. Фермепвн генетической инженерии !б5 вания с целью определения последовательности нуклеотидов в ДНК и т.
д. Первым описанным ферментом этого класса была рестриктаза НгпНП (Ке!!у, Бгп!г!з, !970; Бгп!гп, %!!сох, !970). Молекулярная масса рестриктаз класса П достигает нескольких десятков килодальтон. Рестриктазы (и метилазы) этого класса ферментов действуют как отдельные белки. Расщепляя двунитевую ДНК, они образуют, как правило, 5'р- и 3'ОН-концы. Самые важные характеристики этих рестриктаз — структура их сайтов узнавания и способ расщепления ДНК. По этим признакам их можно разделить на несколько подклассов. Более половины всех рестриктаз относится к подклассу ПР, который представлен ферментами, узнающими тетра-, гекса- и октануклеотидные последовательности с вращательной симметрией второго порядка (подобные структуры называют палиндромами).
Рестриктазы этого гюдкласса лействуют либо на определенные сайты, например, 5'-ТСОА-3' 5'-ТООССА-3' Таа1-сайт 3 АОСТ 5 Ла/1-сайт 3 Ассаат 5 либо на сайты, в которых присутств)чот альтернативные основания, занимающие симметричные позиции. Например, по четыре сайта узнавания имеют рестриктазы У/ае1 и НаеП: 5'-(А/Т)ООСС(А/Т)-3' 5'-РнОСОСРу-3' 3'-(Т/А)ССОС(Т/А)-5' 3'-РуСССОРц-5', соответственно. Здесь и далее Ро — пурин, Ру — циримидин.
Рестриктазы подкласса ПЪ' узнают пента- и г ептануклеотидные палиндромы, в центре которых находится один из двух альтернативных нуклеотидов или любой нуклеотид (!ч). Фланкирующие нуклеотиды, стоящие в симметричных положениях, также могут быть альтернативными: 5'-ОА!чТС-3' 5'-РцОО!чССРу-3' 3'-СТ!чАО-5' 3'-РуСС)х(ООРи-5' Рестриктазы полкласса По! узнают палиндромы, прерываемые несколькими произвольными нуклеотидами.
Примером является 9!1-сайт: 5'-БОССИ,ООСС-3' 3'-ССОО!х),ССОО-5' 1бб Часть В. Ранняя инанннейня Гн иуго Рсстрикзазы подклассов ИЯ и ПТ узнают непалиндромныс последовательпостп, сосюяшис из 4 — 6 и более пар пуклеотилов. Подклассы гпличаются тем, что в первом случае рестрикгазы расьцспляют ДНК на определенном расстоянии отсайта узнавания (от 1 до 20 и н ), а во втором случае — в самом сайте. Примеры таких последовательностей для подкласса ПБ — Мн11-сайт 5'-ССТС(Ч,-3', а для подкласса 1П вЂ” ЯдА1-сайт 5'-САС.нССОСТСО-З'.
При случайном распределении нуклеотидов в ДНК участки, состояпгис из и опрслеленных нуклсотидов, ветре ьзются в среднем через 4" нуклеотидных остатков. Поэтому число сайтов узнавания, приходящихся на один геном или ген известной длины, в какой-то степени можно прогнозировать. Более точный прогноз можно сделать, оценив в сайте узнавания и в изучаемой ДНК содержание АТ- и С)С-пар. По способу расщепления ДНК рссгриктазы класса П распадаются на два типа. Одни осуществляют ступенчатый разрез нитей ДНК (пвложсния гидролизуемых связей на разных нитях не совпадают), а другис — прямой (расшспляются совпадающие связи).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
