Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Внутриклеточная транспозиция генов обеспечивает базальный уровень синтеза белков дифференциации, которые затем при наличии внешних сигналов приволят к заверц1ению дифференцировки клеток. Этот пример наглядно демонстрирует сложность проблем, которые придется решать экспериментатору при попытках геномного конструирования даже у одноклеточных орган измов. Клеточнш~ инженериярастений. Растения по нраву называют гениальными инженерами природы. Их уникальное свойство восстанавливаться гюсле повреждений обусловлено тем, что даже зрелые растительные клетки сохраняют способносп, к делению и передифференцировке. Такая пластичность (то т и п о те н т н о от. ь ) наглядно проявляется при культивировании растительной ткани в среде, содержащей необходимые питательные вещества (органические и неорганические) и факторы роста (ф и то гор м о н ы ).
Глава 5, Канаки 139 Клетки ткани дсдиффсрсппируются и начинают делиться, образуя с)1жЗнитслыю Одн011Одн) 10 масс)', называем)то к а ля )'с О м . СВОЙ- ства и путь развития каллуса определя1от фитогормоны ауксины и цитокинины (рис. 5.3), влияющие на скорость деления клеток, их дифферецциацню и органогснез. При огпнмальном соотношении концентраций фитогормонов (оно разнос лля разных тканей и разных растений) и)утри каллуса многих лвудольн ых растений формируются побеги, гапем корни, а через 4 — б месяцев можно получить взрослое рас)еннс(рис. 5.4).
Если концентрация ауксннов в среде существенно больше, чем цитокининов, то формируются только корни, если отношение конце1 праций обра нос — образу)отса только побсп1. нн-сиз Гч -н. Цитокнннн Ауксин 1Х -мссиллнннопурин) б 1ннкокуксуснкк кислотн) Рис. 5.3. Строение растительных фитогормо1юв ауксина и цитокинннн В жилкой срслс пол действием пектиназ каллус распадается на изолированныс клетки. Взятыс отсюда отдельные клетки на плотной среде после ряда делений вновь образуют каллус, из которого в ряде случаев (клетки табака, моркови„петунии, томата, картофеля) удастся получить целое растение. Целое растение можно получить даже из протопластов, т.
е. из клеток, нс имеющих клеточных с~спок. Протопласты получают из многих видов растений. Лучгпим их источником служат клетки молодых листьев, которые сначала обрабатывают псктиназами для удаления межклсточных связок, а затем цсллюлазами для удаления самой клеточной стенки. После зтого ихпомец1ают на плотные среды, где через 5— !О дней происходит регенерация клеточной стенки и начинается деление клеток. Дальнейшее развитие процесса идет стандартным образом: образованно каллуса — э формирование побегов и корней — > становление целоуо растения (см.
рис. 5.4). Перенос в полну Ию. р«ы ый лист Образование корней Образование набегов Перенос на акаро определенной концентрацией гормона Изолированные! ',.- юзстки ", . '."..л Обработка ./ целлюлазой е н 1', Образование кжллуса :.- -Г -"л Первое ~ ~ !' Перенос в жидкую среду и кпсточной стенки Рис. 5.4. Схема ретенерации растений из изолированных клеток или протопластов ! изолнроеанние лротопласты 140 Часть б Генная инзненерия Ун унио Излзельчеиис ,н -" Обрабо~ ка! псктиназоуй Глава 5. Клевака 141 В опытах по регенерации растений был обнаружен эффект повышенного темпа спонтанного мугагенсза культивируемых клеток. Он заключается в следующем. Растения, выращенные из отдельных клеток одной и той жс каллусной ткани, проявляют большую генетическую вариабельность и различаются по многим признакам.
Причины этого нс ясны. Вероятнес всего, мутации возникаю~ вследствие дсрспрсссии гюдвижных генетических элементов. Но как бы то ни было, данный эффект даст возможность осуществлять просмотр (скрининг) вариантов и отбирать тс из них, которые обладают полезными агрономическими признаками. Скрининг ведут на двух уровнях — уровне клеток и организма. Скрининг клеток отличается высокой эффективностью. Однако большинство ценных для человека признаков растений (продуктивность, качество, устойчивость к полеганию, время цветения и созревания и т.
п.) носит полигснный характер. Природа этих генов и особенности их взаимодействия в процессе формирования какого-либо признака пока не известны. Поэтому полученные полезныс признаки не выражаются в культивируемых клетках, так что отбор по ним ведут только на организмснном уровне, В то жс время по таким признакам, как устойчивость к ионам тяжелых металлов, солям, к неоптимальным рН, гербипидам, скрипинг на клеточном уровне дает возможность прогнозировать свойства растений по свойствам клеток. Пластичность растений простирается сюль далеко, что удастся манипулировать их гсномами и даже получать искусственно новыс виды, в том числе и практически лажные для человека.
Это направление исследований можно назвать геном ной инжен с р и е й, хотя первые успехи здесь были достигнуты сшс до наступления "генно-инженерной эры'*. Одним из способов получения таких растений является межвидовая гибридизация перскрсстно-оплодотворяющихся видов. Однако образующиеся в результате применения этого способа гибриды, в клетках которых геном каждого родителя представлен одной копией, нестабильны. Тем нс менее, ряд приемов позволяет вызвать удвоение числа хромосом и получить амфидиплоиды, способные давать потомство. Классическим примером этого служит проведенная в 1927 году работа Карпсченко по выведению плодовитого межродового гибрида 142 Часть 1. Хенная инженерия ог егго капусты и редьки. Широко известен также амфидиплоид Тпугса1е, образованный вследствие полового скрещивания пшеницы и ржи.
Разработка и применение способов получения и слияния протопластов растительных клеток, а также регенерации у них клеточной стенки в сочетании с методами культивирования и дифференцировки клеток ггг ггггео позволили конструировать рекомбинанты, минуя половой процесс, т. е. создавать с о м а т и— ч с с к и е г и б р и д ы .
Как известно, процесс слияния протопластов неспецифичен, Слияние протопластов осуществляют в жидких средах с помощью полиэтиленгликоля. Это позволяет объединять протопласты отдаленных видов растений, между которыми половая гибридизация невозможна, и таким образом расширять круг растений, вовлекаемых в гибридизациях Первые успехи в получении сомгп ических гибридов растений данным методом бьии достигнуты в середине 60-х годов. Вначале были выделены межвидовые гибриды (табака, моркови, петунии и дурмана). Затем удалось получить и межродовые соматические гибриды (картофель х томат, дурман х беладонна).
Характерной чертой соматических гибридов является нестабильность их генома (прелрасположенность к пспере хромосом). Например, из 26 изученных в одном опыте соматических гибрипов !угеоГгапа ~!аггеа х Мгеоггапа )апезе(огтгг только три оказались стабилы гыми амфилиплоидамн и содержали точно удвоенный набор хромосом кажлого из организмов. Соматическая еггбридизация животных клеток. Осповныс успехи в молекулярной биологии клеток животных достигнуты благодаря использованиго клеточных культур. Изочпровагшые клетки можно получить из любой ткани путем разрушения мсжклсточных контактов протсолитичсскими ферментами. Клетки большинства видов животных способны размножаться в подходящих условиях, причем, как правило, на твердых поверхностях.
Часто эти клетки сохранягот признаки дифференцировки тех тканей, из которых они бьши получены. Однако после 50 — !00 циклов деления культивируемыс клетки погибают. Изредка в этих культурах выживают мутантные клетки, которые дают начало бессмертным клеточным линиям. На твердых повсрхносгях они образуют монослой, после чего их рост прекращается. В отличие от них, бессмертные линии раковых клеток размножаготся в жидких Глава 5. Клетки 143 срсдах, а на твердых поверхностях они образуют много слосв.
Наиболее извссп1ы в лабораторной практике клеточные линии фибробластов мыши Х1Н-ЗТЗ, зпитслиальных клсгок человека Нс1.а, миобластов крысы 1 б, плазм пичсских клсток мыши БР2 и др. Важным условием в работе с клеточными культурами являстся наличие в клсткс с с л с к т и в н ы х м а р к с р о в. Сслсктивность маркеров животного происхожлсния, используемых в настоягдсс время, обусловливается особснностями биосинтсза рибонуклсотидов в клстках животных. Он осущсствлястся двумя путями: Ые логи, а также из готовых азотистых оснований и их аналогов, При синтсзс пуринов е(е вою вначалс образустся инозиновая кислота (1МР), а из нес — адсниловая (АМР) и гуаниловая (ОМР) кислоты чсрсз соотвстствснно адснилосукцинат и ксантиловую кислоту (ХМР).
Синтез пуринов из готовых азотистых оснований осущсствляют адснинфосфорибозилтрансфераза (АРКТ) из адснина, гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфсраза (НЬРКТ) из гипоксаптина и гуанина, а такжс бактериальная ксантингуанин11юсфорибозилтрансфсраза (ХОРКТ) из ксантина (рис. 5.5,а). Как видно из привсдснной схемы, для создания сслсктивных условий синт сз 1МР е(е лого нсобходимо блокировать. Это делают с помощью азассрина или аминоптсрина. Послслний полавляет такжс образование е(е логи тимидинмонофосфата, после чего он может синтсзировгтгься только из тимидина с помощью тимидинкиназы (ТК). В рсзультатс на срсдс с гипоксантином, аминоптсрином и тимидином (НАТ-срсда) развиваются лишь клетки с гонами Н6РК Т ' и ТК, а на срсдс с азассрином и адснином — только с гоном АРКТ'. Эти гены можно использовать в качсствс сслсктивных маркеров, соли рсциписнтныс клстки нссут мутации Н6РЕГ, ТК или АРКТ .
Сслсктивным маркером у животных клеток являстся такжс мультиплицированный гон Лак Он кодируст фсрмснт дигидрофолатрсдуктазу (ОНРК), в отсутствие которого клстки не синтсзируют тстрагидрофолат, участвующий в синтсзе дАТР из глицина и ЛТР из аспартата (рис. 5.5,б). Клетки с одним геном ВФ в присутствии аминоптсрина или мстотрсксата (структурныс аналоги фолисвой кислоты) погибают. Выживают лишь клетки с боль- 144 Часть Н Генная июееяерия (и ито шим числом копий этого гена (их число варьирует от 40 до 400), так как при повышенной концентрации 0НГК блокирование этого фермента оказывается неполным. Мультиплицированные гены либо интегрированы в хромосому стабильных линий клеток, либо находятся в клетке в виде многих линейных внсхромосомных элементов, каждый из которых содержит 2 — 4 гена п)(тк Такис элементы называют а м и л и к о н а м и .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
