Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Снвтел нурнвов венето аЛМР 4 — ЛМР 4 — Лв и « — ВИР— ~ХМР— ~ аМР -Р СОМР оу'Вливал л лрвт нспрвт хорат норат Филер налыил) Гилонеавтин Ковелли Гуанин б) Днтллроеоллт Лнниавтерин вловировавие —. р онра Меолренеат Глиоин— — ьалтр —.- ь ддк ллвартат — — — — — - ь атн' В дяк Рис 55. Схсма биссиитсзн пурииов (а) и пиримидиисв (б) в животных клетках Имеются специфические субстраты для селекции клеток с мультиплицированными генами аденозиндсаминазы (Аь)А), аспарагинсинтстазы (АК), карбамилфосфатсинтстазы (СА1)) и др. Методы генной инженерии )и 1ягуо позволили ввести в практику работы с животными клетками также селективные маркеры бактериального происхождения, в частности гены тру и аео.
Жи- Глава 5. Клетки 145 вгпныс клетки нс могут использовать ксантин для синтеза С1МР, но ссли в них ввссти гон КР1, кодирующий ксантингуанинфосфорибозилтрансфсразу (ХГ1РКТ), они приобретают эту способность. Извсспю что, (эМР образустся чсрез 1МР из гипоксантина с помощью фсрмснта НГэРКТ. Если жс подавить дсйствис НС1РКТ микофснолыюй кислотой„а синтез пуринов с(е лото аминоптсри!юм, то на срсдс с адснином, ксанти!юм и этими ядами ген Кд! можно использовать как сслсктивный маркер дажс для нсмугантных живгпнь!х клеток Гсн пео из транспозона Тп5, кодирующии аминогли козидфосфотрансфсразу и обсспсчиваюший устоичивость бактсрий к канамицину и нсомицину, придаст животным клсткам устойчивость к антибиотику хэ413.
Этот ген используется квк сслскгиьч!ый маркер такжс при работе с клстками лрожжей и растсний. Клстки животных цс имсют клеточной стоики, поэтому, подоб!ю протопластам, они могут сливаться в присутствии полиэтилснгликоля, образуя гсгерокарион — клстку с двумя ялрами. Гстсрокарион дслится митотически и превращастся в гибридную клстку с одним ядром, в котором содержится полный комплскт хромосом одной из родительских клеток и часть хромосом другой клетки Эта лабор порная процслура была названа методом г и б р ил и з ации соматичсских клсток.
С!впснь стабильности соматических гибрилов животных клсток зависит от фило! енстпческой близости родитсльских вилов. У мсжвидовых ! ибридов у!рачивастся небольшое число хромосом, а у гибридных клсток чсловск х комар или мышь к курица хромосомы одного из родителсй вскоре после образования п!бридов почти полностью элиминируются. Элиминация хромосом видоспсцифична: в приведснных примсрах утрачиваются хромосомы комара и курицы. В гибридах мышь х чсловск теряются хромосомы чсловска.
Поэтому такие гибриды особенно удобны для картирования генов человека и изук!сния мсханизмов их регуляции. Это Объясн5!стоя тсм что срсди подобных пибридов всегда можно найти клоны, содсржащис опрсдсленнук! хромосому человека, тем болес что чсловсчсскис хромосомы под микроскопом замстно отличаются от хромосом мыши. В случае транслокации генов из хромосом одной родительской клстки в хромосомы дру!Ой образуются стабильные гибриды. Например, при длительном пассировании на НАТ-среде гибридных клеток мышь х человек, содержащих хромосому человека с геном ТК", были выделены клоны, утратившие эту хромосому, но со- хранившие ген К", поскольку он транслоцировался на одну нз хромосом мыши.
,, ~ — Аотиге нане ' ° Антигон летериииаити1 Клетки навкт В-лиц фоцити В-лимфоцити Яф' ф ф ф~ йлт 6~Ь, Смета ааиие антитела Моио1шоиалаиие антитела Рис. 5.6. Схема конструирования гибридом. В ответ нв иммунизацию мьппи антигеном, имеюшим четыре антигениых летерминанты, образуются В-лимфопиты четырех типов. Слияние с клетками миеломы делает их бессмертными, что позволяет затем разделить их и клонировать 146 Часть К Генная ггюкенерил гл тат в Г' Е~П Глава 5 Клетки 147 Примсром практичсского примснсния мстода гибридизации соматичсских клсток являстся создание г и б р и д о м — клсток, способных производить моноклональныс антитела. Всс антитела (иммуноглобулины) в принципс устросны одинаково, но в организмс животного имеются миллионы их вариантов.
Потснциально синтез антитсл обсспсчивастся таким жс количеством различных линий В-лимфоцитов, находящихся в крови и сслсзснкс. Каждый из лимфоцитов способен производить строго опрсдслсннос анти- тело. Однако в ответ на инъекцию бслка-антигсна в животном активируются различные В-лимфоциты и вырабатываются разныс антитела. Зто происходит вслсдствис того, что на одной молекуле антигона может быть несколько антигснных дстсрминант или одна дстсрминанта вызывает синтез нсскольких антитсл, спсцифичных к ной в разной степени. Таким образом, обычныс сыворотки содсржат смссь антитсл, разделить которыс практически невозможно.
Гибридомы способны производить строго определенные антитела с заданной спсцифичносгью. Имснпо эта особснносгь являстся наиболсс ценным свойством, отличающим их от природных продуцснтов моноклональных антител — клсток мислом. Мисломы прсдставлшот собой злокачсствснныс костно-мозговыс опухоли. Лкзбая такая опухоль состоит из клона плазматичсских клсток, произошедших от олного псрсрождснного прслшсствснника лимфоцита. Поэтому в каждой опухоли синтсзируются в большом количсстве опрсдслснпыс антитсла, но спсцифичность их случайна и неизвестна.
Что жс касастся нормальных лимфоцитов, то среди них можно выделить клетки, синтсзирующис заданныс иммуноглобулины. Однако поддерживать их в культурс нс удастся. Гибридомы сочстают в ссбс свойства лимфоцитов производить опрсдслснныс антитела и способность мислом бссконсчно поддсрживаться в культуре (Кс)1)сг, Мйзгсишц ! 975), Для создания таких гибридных клсток (рис. 5.6) прсждс вссго иммунизируют мышей, вводя им заданный антигсн. В отвст на это в сслсзснкс мышой начинастся пролифсрация В-лнмфоцитов с заданной спсцифичностью антител. Далсс выделяют клстки сслезснки и гибридизируют их с клетками мисломы, в которые предварительно вводят мутацию Н6РлТ-. Зто позволяет отбирать гибридные клетки 143 г!асть !. Генная инакенерия га 1н1ш на среде НАТ, не поддерживающей развитие клеток мисломы из-за мутации (клетки лимфоцитов в принципе нс способны образовывать колонии).
Отобранные клоны гибридом тестируют на специфичность антител, продуцирусмых ими, после чего нужныс клоны размножают и вьшсляют из них антитела. Для размножения гибридом удобно использовать мышей той линии, из которых были взяты В-лимфопиты, У животных после инъекции плбрилом развиваются опухоли, выделяющие специфические моноклональные антитела. Концентрация их в сыворотке крови достигает исключительно высокого уровня (более !О мгна ! мл сыворотки). В настоящее время появилась возможность выделять индивидуальныс хромосомы и, следовательно, использовать их для направленной трансформации животных клеток. Получаемые данным методом трансформшп ы, как правило, нестабильны. Однако в их популяции можно найти стабильные трансформанты, у которых часть хромосомы донорной клетки интегрировалась в какую-либо хромосому реципиента.
Такис клетки позволяк1т картировать спеплснные гены. Клонирование лепевоггиеьп. Серьезные успехи, досп~п~утые в разработке методов манипулирования и1 и!го с ранними эмбрионами животных, позволили довести ряд экспериментов с уровня клеток ло организма (большинство работ сделано на мышах). Конечно, наиболес впечатляющими являются достижения по получению транс- генных животных с использованием клонированных генов (см.
|л. ! 3). Однако и результаты опытов по псрскомбинации зародышевых клеток и замене ядер, позволившие получить клоны животных или животные химеры (см. стр. !49), лали многосдля понимания механизмов дифференцировки клеток в процессе онтогенеза. Напомним, что когда число клеток (бластомср) эмбриона не превышает восьми, онн ьчпс тотипотентны (не дифференцированы) и каждая пз них может дать начало новому организму. Это поз~юляст проводить искусственное разделение 4 — 8-клеточных эмбрионов на отдельные клетки, культивировать их !и игго до стадии бластоцисты и имплантировать в матку псевдобеременных животных-реципиентов ("приемных" матерей).
Таким путем можно клонировать животных, т. с. получать генотипически одинаковые особи (однояицсвых близнецов). Глава 5. Клетки 149 Другая возможность заключается в использовании эмбриональных стволовых клеток, получаемых из бластоцист. Они являются плюрипотентными (не полностью дифференцированными), и от них в организме взрослых животных ведут начало многие типы клеток, включая зародышевые. Перенос ядра из стволовой клетки в только что оплодотворенную (и илго яйцеклетку, из которой удалены оба пронуклеуса, получение бластоцисты и ес имплантация в матку "приемнои" матери приводит к рождению нормального животного. Число идентичных стволовых клеток нс ограничено, поскольку их можно клонировать, поэтому количество получаемых однояйцевых близнецов зависит только от доступности яйцеклсток и наличия "приемных" матерей.
Известие о клонировании животных для широкой общественности прозвучало как сенсация, благодаря комментариям прессы к разработке технологии получения клонированных овец (%йпзщ ег аl., ! 997). Между тем, сенсационность этой работы закгпочается только в том, что впервые для млекопитающих с целью клонирования удалось использовать ядра соматических клеток (клеток молочной железы взрослой овцы). Для земноводных подобный успех был достигнут еще до наступления генно-инженерной "эры", когда ядро яйцсклеток лягушки заменяли ядром, взятым из эпителиальных клеток кишечника головастика (Овп5оп, 1962).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
