Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 24
Текст из файла (страница 24)
4.11; сль также рис. 2.5 и 4.10). В С(67-области располагаются гены 5 и (7(в двух вариантах), опрелеляющие хозяйскую специфичность фага, которая, как вы- Глава 4. Фаги 123 яснилось, зависит от способа получения лизата. В ДНК фагов, полученных после инфицирования и лизиса клеток, область С('6) находится в (4)-ориентации. Такие фаги адсорбируются только на клетках штаммов Е. сор К-12и некоторых штаммов Х Орйпяппмя. В ДНК фагов, полученных после индукции развития профагов, область С('6) ориентируется и в (+)-, и в (-)-положениях. Фаги с ориентацией области С('6) в (-)-положении приобретают способ- ность адсорбироваться гга клетках С.
Егеивг(гг', Я~. хоипей Е. сой С, но перестают инфицировать клетки Е. соб К-12, ахк сг»ь е е — + Э 4 4 . Сй вс в» и 0' в»' явь уха Бя Ми1+) й Ф вЂ” 'ь + — 4 —; —. — вй' яе Б» и гу в»' рг»к яяй Рис. 4.11. Строение вращающихся областей у фагов Р1, Ми и дефектис>го профага е14. р,, — промотор ~ снов Ю и (', стрелки указывают направление транскрипции генов В структурах соответствующих фатов были обнаружены различные белки (1Ыа, 1984). В фагах с областью СЩ в (+)-ориентации синтезируются 5 и Убелки, а с областью СГ6) в (-)-ориентации — У и 6" белки. Их гены построены следующим образом.
Промотор находится слева от области С1'6), а рядом с ним— константная часть гена 5 — сегмент 8,, общий для генов 5 и 5' (см. рис. 4.11). На разных концах области С(6) помещаются лишь вариабельные части генов Я и 5' (Ю и Я'), а гены Уи 0' полностью располагаются в ней.
Поэтому при ее (+)-ориентации синтезируются белки Я,— Е„и 6, а при ( — )-ориентации — белки Ю,— Я„' 124 Часть !. Генна» икаеенеуих !и Ыто Фвг М13 Этот нитевидный фаг, а также близкородственные фаги П и Гг( обладают однонитевыми ДНК длиной б407 нуклеотидов, гомо- логичными на 97 %. У каждого из фагов имеется 10 генов, 7 из которых вовлечены и морфогенез кшюиды. Белок ярЛН является ее основным структурным компонентом, а яр!!! обусловливает адсорбцию фага на Р-пили (см. гл. 3), через которые фаговая ДНК, обозначаемая как (+)-нить, проникает в клетки, Между П и 7 !' генами располагается спейсер, содержащий сайт уас, необходимый для морфогенеза, и два ог1-сайта (рис. 4.12). Один из ннх, оп(-), используется для инициации синтеза комплементарной ( — )- нити, в результате чего образуется двунитевая репликативная г)юрма (РФ).
Праймирование ведет бактериальная РНК-полимераза, а элонгацию — ДНК-полимсраза Ш. '-О-"О- О чведц п/' ~,,'- ': в,р !Х чц! Рис. 4.! 2. Генсгическаа карта фага М! 3 и схема репликации его олнонитевой ДНК. Гены фага обозначены цифрами 1 — Х; через (+)-нить обозначена ДНК, вылсляемая из фага; комплементарная нить обозначена через ( — ).
Стрелки на карте — направление репликации с разных опьсайтов; тонкие линии — ( — )-нить; штриховая линия— вновь синтезированная (+)-нить. Масштаб указан в т.п.н. и б'. Рядом с областью С('6) имеется энхансер з!з (вес!пенсе Гог шчегз(оп з!1шы(а!!оп). В его присутствии независимо от расположения и ориентации области частота инверсии увеличивается в десятки раз. Этому способствует бакгериальный белок Р!з (Гас!ог Гог шчеггюп вг1шц(а!1оп), связывакнцийся с энхансером. Аналогичную систему инверсии имеютдефектный лямбдоилный профаг е14 и плазмнда р! 5В, обладающие инвертазами Р!и и Мш, соответственно.
Глава 4. Фага 125 Вновь синтезированная ( — )-нить в составе РФ играет двойную роль: с нее идет однонаправленная транскрипция, и она служит матрицей лля синтеза лочерних (+)-нитей ДН К по механизму катящегося кольца. Для этого процесса образовавшийся фаговый белок ярП вводит ник в оп(+)-сайте на (+)-нити, после чего клеточная геликаза Кер вытесняет 5'-конец этой нити, а ДНК- полимераза 1П удлиняет ее 3'-конец. После завершения раунда репликации вытесненная (ь)-нить "отрезается" белком ярП в том же сайте, где при инициации репликации вводится ник, циркуляризуется и снова превращается в РФ.
После накопления в клетке 100 — 200 молекул РФ дальнейшее их образование прекра! цается, так как кольцевые (+)-нити покрываются фаговым ВВВ-белком ба', блокируя их превращение в РФ. Однонитевые ДНК направляются в периплазматическое пространство и упаковываются там в фаговые белки. Образовавшиеся вирионы (до 1000 частиц из одной клетки за одну генерацию) покидают бактерии, не вызывая их лизиса, Эволюционные взаимоотношения нлазмид и фатов Плазмиды и фаги играют фундаментальную роль в эволюции бактерий, содействуя горизонтальному переносу генетических модулей, кодирующих самые разнообразные функции.
Природа использует их в качестве своеобразных векторов для своих генно- инженерных целей. Паразитические и (или) симбиотические взаимодействия этих автономно реплицирующихся генетических элементов между собой, а также со своими хозяевами способствовали быстрой и многосторонней эволюции молекулярных адаптивных механизмов. Изучение эволюции таких сравнительно простых биологических объектов может способствовать пониманию закономерностей, которым следует молекулярная эволюция более сложных биологических систем.
Наиболее интересными объектами в этом плане являкпся фазмиды. Напомним, что фазмиды сочетают в себе свойства плазмид и фатов. Эти свойства разделены во времени. В лизогенном состоянии фазмида ведет себя как плазмида, а при литическом развитии — как вирус. Существование фазмид ставит фундаментальную проблему эволюционно~о плана об их происхождении.
Как ! 26 Часть 1. Генная инякенерня ен нпн следует рассматривать Фазмиды с эволюционой точки зрения? Являются ли они промежуточными звеньями между плазмидами и бактериальными вирусами или продуктом их эволюционного взаимодейсгвия? Тесная связь между плазмпдами и фагами в современной истории, насчитывающей сотни миллионов лет, подтверждена многочисленными экспериментами. С целью расширения "жизненного пространства" одни плазмиды приобрели способность к трансмиссивности, т.
е. переносу в другие клетки методом конъгации (например, современные плазмиды типа Р). Другис "обзавелись'* информацией о морфогенетических и литических функциях и стали вирусами, что позволило им приобрести способносгь к внеклеточной стадии жизни (например, фаг Р1). Третьи "научились"* пользоваться чужими морфогенетичсскими и литическими функциями и получили способность выходить из клетки не в своем "одеянии", став вирусами-сателлитами 1например, фаг Р4; 1 1пйрчз1 ег а!., 1993).
Историю же происхождения плазмид и вирусов аЬ ого можно пытаться восстановить только ло~ическим путем. Плазмиды и вирусы не могут размножаться вне клеток, поэтому, вероятнее всего, их рспликаторы произошли от клеточных. Представление о плазмидах как об обособившихся клеточных репликаторах не вызывает логических противоречий. Можно также лопуститть что в процессе эволюции такой репликатор приобрел ин4юрмацию о белковой оболочке, которая затем трансформировалась в капсид.
Так в результате могли образоваться предки фазмид. Конечно образование фазмид происходило и в относительно недавнее время благодаря рекомбинации между плазмидными и фаговыми геномами. В частности, учитывая высокую степень гомологии между структурными генами фагов й80 и?415, можно предположить, что к созданию фазмиды Х15 привела рекомбинация цекогорои "реликтовой" линейной плазмиды, имеющей шпилечные концы, с "прародителем" фага ф80. А что можно сказать о подавляющем большинстве вирусов, которые являются вирулентными и нс имеют плазмидной Фазы жизни? Вызывает сомнение, что в процессе образования первич- Глава 4.
Фаги 127 ных вирусов они прошли мимо плазмиднои "фазы жизни*'. Ведь их репликаторам необходимо было иметь достаточно времени, чтобы приобрести (о!юрмировагь?) информацию о морфогенетических и литических функциях и стать вирусами как таковыми. В течение этого времени их репликаторы были, очевидно, автономными„ т, е. были плазмилами. Следовательно, первые вирусы были фазмидами.
Затем большинство вирусов, по-видимому, утратило плазм идные свойства, в результате чего они потеряли универсальность, но стали более эффективными литическими агентами. Таким образом, вероятнее всего, бактериальные вирусы являются редуцированными формами фазмид. Интересен и более общий аспект обсуждаемой проблемы. Оказалосгь что концевые шпильки сходны по строению у бактериальных линейных плазмид и цоксвирусов (Н!ппеЬцзсЬ, ВагЬоцг, 1991). Близкое строение имеют и концевые шпильки линейных плазмид некоторых низших грибов (М(уазЬ1!а ег а?., 1990) и линейных митохондрий у парамеций (РпсЬап1, Сцшп!1пяз, 1981). Эти неожиданные и важные факты указывают на возможность горизонтальг!ого переноса генного модуля, ответственного за их образование„ между эу- и прокариотами.
ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 4.!. Будет ли трапсдуцирующий фаг Лю/АВ, полученный методом делеций, дефектным илн жизнеспособным? 4.2. Длина линейной ДНК, выделяемой из частиц фага Р!, превышает размер генома на 10 тзьн. Из-за особенностей механизма упаковки фаговой ДНК ес концы гомслогичны.
Благодаря КесА-зависимой рекомбинации по участкам гомологии фаговая ДНК после инфицирования клеток циркуляризуется. Равна ли длина кольцевой ДНК размеру фагового генома или прсвьцлает его? 4.3. Сформулируйте условия, при которых фаг Л мог бы осуществлять общую трансдукцию. 4.4. Сформулируйте условия, при которых фас Р! мог бы осуществлять специфическую трансдукцию. 45. Как следует рассматривать фазмиды с эволюционной точки зрения? Являются ли они промежуточными звеньями межлу плазмидамн ц бактериальными вирусами (плазмиды — э фазмиды — > аирулентные фаги) или продуктом их зволгоционного взаимодействия 128 Часть!. Генная ияз>геиегло»л нйо (плазь>иды + вирулснтные фагн = фазан>лы)? ОГ>судите сильные и слабые стороны этих прелположсний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
