Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Рис. 4.7. Механизм трансдукции фагом Л неконыогативной плазмилы рМВ9, содержащей траиспозоя Тпз: а — образование коинтеграта в донорных клетках; б — распад коинтеграга в реципиентных клетках < мРНК геа вага 1ЯО 1Ч рг. ГЗ!О та!Ю 1ЗШО с1 ОР— Ф Ф— гаа аан ЙЮО рл Х 1З!О та!О !З10 а1 ОР мРНК Рис. 4 8. Инверсия регулярного участка !1вга ЛсТп10 вследствие рекомбинации между инсерциями 1810. Жирными стрелками обозначены мРНК, тонки- ми — ориентации ! 8-элементов 1!8 Часть!. Генная нняеенерня !л етео Уже отмечалось, что транспозоиы придают отдельным участкам генома мобильные свойства.
Подобные свойства были обнаружены у фага )., имеюгцего около гена с) транспозоп Тп10. У этого фага с частотой 1О ' ипвертируег участок ДН К, иесуший промотор р1. и ген %(рис. 4.8). Фаги, содержащие инвертированный участок, обладаю~ фенотипом Ксс! Оавт, так как у цих иет транскрипции одноимениых генов. Эти фанз плохо развиваются В клетках геЫ, но титруются иа лизогеиах с профагом Р2 (Бр! -Феиотип). Мутантные фаги "ревертируют" в исходную Форму также с частотой 10 '. Установлено, что вращение участка с геном )У зависит от КесА-функции.
Поэтому предполагается, что у данного мугацтиого фага около генов 8агл и )у есть еше один 1Я 0-элемецт и что у данного мугаптиого фага между ним и концевым 1Я 0-элемецтом зраиспозоиа Тп! О происходит внутримолекулярпая гомологическая рекомбииа|тия.
Подобный пример генной инженерии (п р!гв можно продемонстрировать и па профаге ),с!82, иитегрировашюм в область еа( — апВ-сайт через 182- элементы (см. рис. 4.5). Эти элементы были ориентированы таким образом, что профаг локализовался в направлении, противоположном обы щому. Поэтому направление сайгон РОР' и ВОВ' также изменилось иа противоположное.
В указанных условиях внутримолекуляриая сайт-специфическая рекомбииация сайтов РОР' и ВОВ' обусловила инверсию участка ДНК, лежащего между ними, что повлекло за собой разрыв профага (рис. 4.5,6). Фаги лямбдоидиого семейства Фаги, родственные фагу 7, называют лямбдоидными; оии составляют целое семейство. Гепомы лямбдоилиых фатов имеют сходное строение, практически одинаковый набор и порядок генов, олииаковый механизм лизогепии через интеграцию профага в бактериальпую хромосому.
Родствен ность фатов определяется по возможности генетической рекомбинации между членами семейства. Сравнение геномов любых двух лямбдоидиых фатов выявляет значительные расхождения в последовательности пуклеотидов в одних сегментах и их практическую илентич ность в других. Эта высокая полиморфпость ДНК лямбдоидпых фагов определяет их биологическую специфичность.
Специфичными могут быть отдельные белки (репрессоры С!, определяюц!ие иммупитетлизоге- Глава 4. Фага 119 нов; белки 8рΠ— инициаторы синтеза ДНК; белки — антитерминаторы транскрипции 8рЫ и 8РО: белки терминазы 8рА и 8рМя1, разрезаюшие ДНК в соз-сайте; белок 8р), определяющий круг клеток-хозяев; белок 1пй осуществляющий интеграцию профага), а также отдельные механизмы (упаковки ДНК, когггроля ранних Функций, иммунитета, лизиса). Подобную полиморфность можно проиллюсгрировать на примере Фагов ),, 21, Р22 и 434. Профаги ). и 434 интегрируются в идентичные сайты на бактериальной хромосоме и имеют взаимозаменяемые интегразы, но хозяйская специфичность и специфичность к репрессии (иммунитет) у них различна. чзаги 21 и Р22 (его хозяином являются клетки Х 1урлллиглтт) имеют близкую специфичносгь к репрессии, но разную хозяйскую специфичносп, и разные сайты интеграции их профагов.
В то же время интеграза 2! близка по строению к )-интегразе, а интеграза Р22 нет. По хозяйской специфичности сходны только Фаги Х и 21. Более детальное рассмотрение структуры фаговых генов выявило дополнительную характеристику семейства. Даже внутри высокогомологичных сегментов ДН К встречаются вставки, происходящие из негомологичных участков других лямбдоидных фагов, а внутри гетерологичных сегментов существуют короткие последовательности, идентичные локусам других Фагов. Кажется очевидным„ что все члены семейства произошли в процессе эволюции от общего предка, но построить древо эволюционного родства оказалось затруднительным, так как Фаги интенсивно рекомбинировали и, повидимому, продолжают рекомбинировать друг с другом.
Поэтому лямбдоидные фаги предлагается рассматривать как отдельные виды, которые приобрели функциональные генетические модули из общего пула генов (СагпрЬеИ, Вобиенц 1983; СатрЬеИ, 1984; СагпрЬей, 1988). Этот пул генов составляют сами фаги, нх профаги и дефектные профаги лямбдоидного типа (в хромосоме Е. со11 К-! 2 их обнаружено 4 — О(,Р12, е14, гас и г)!и). Наиболее естесгвенной представляется рекомбинация между инфицирующим фагом и гетероиммунными профагами, активными или дефектными.
Определение семейства лямбдоидных фагов„очевидно, будет изменено в результате установленного факта, что колифаг Ы15 относится фактически к этому же семейству. Профаг этого Фага 120 Часть !. Генная иаженгрия и! ггги Образов анне 1 тсаоыер 1 зннв ! 1 1 сося Н15 1 Поздние гены сояв а) соя1.
1 Позянис гены Ранние гены 1 ! Интеграция 1 !она 1 !ев. Образование ! 6) Н15 Раннее гены Позвнис гены 1 анк ъ Интеграция 1 1нян ! Рис. 4 9. Сравнение гсноыов фатов (а) и профагов (б) )Ч ! 5 и а ДНК фага )х!15, как и ), ДНК, имеет липкие концы, а физические карты фага и профага пермугированы по кольцу. Геном фаш )х! 15, как и улямбдоидных фгв ов, устроен по блочному принципу: его ранние и поздние гены кластированы. Фаг М15 и лямбдоидный фаг ф!)О близки по характеру лизогенпой конверсии и структуре гена сод ответственного за этот феномен, а также по физической гомологии большинства поздних генов этих фагов. В то же время фаг 1Ч15 и лямбдоилные фап! сушественно различны по механизму лизогении: !гямбдоидные профап! интегрируются в бактериальную хромосому гю Кэмпбеллу, а профаг )Ч!5 находится в плазмидном состоянии.
Тем нс менее, блок генов, определяющих лизе!ейное (!пазмидное) соспиниеДНК фага )415, находится, как и у лямбдоидных фатов, в середине фагового генома (рис. 4.9,а). Сходна и генетическая структура профитов обоих фагов (рис. 4.9,б). Кроме упомянутого выше блока ! енов геном профага )х) 15 содержит блок ранних генов, ведущих его литическую репликацию и уникале11: оз! является плазмидой (Каюп, Бс)зи!йа, 1970), причем ее ДНК линсйна и имеет ковалентно замкнутые (шпилечные) концы (Сварчевский, Рыбчин, !984; см. рис. 3.1б,а; 3.17). В классификации способов лизогении этот пример до сих пор является единственным, другие профаги подобного строения пока не описаны. Глава 4.
Фаги 121 поддерживыощих плазмидное состояние„а также блок пощ1них генов, кодирующих структурныс белки и ферменты, обеспечивающие лизис клетки. Первые два блока уникальны, а тстий принадлежит лямбдоидному семейству (см. полная последовательность, СепВап)с ассезз!оп пшпЬег АР064539). Отметим, что умеренные фаги, профаг которых находится в плазмидном сосгоянии, называют фаз м идам и. Именно к таким обьектам относится фаг Ь! ! 5. Фаг Р1 Фаг Р! является самым крупным умеренным фагом Е. сой, размер его генома около 90 т.п.н. Он также относится к фазмидам, т. е. способен развиваться и литически, и поддерживаться в виде низкокопийной кольцевой плазмиды, В соответствии с таким способом жизни фаг обладает двумя репликаторами — ол1 для литической рспликации и опй для плазмидной репликации (рис.
4Л О), но в обоих случаях репликация ведется бактериальной ДНК.-полимеразой П1 (см. обзор Уагщо!гппз)су, 51егпЬегя, !988). палас '' сы ~"м' сы а рпс оыа -рЛ ысл рйГ Рис. 4.10. Упрощенная генетическая карта фага Р1 (по Уаппо! !пзку, довеска, 1993). Размер' 1 единица карты равна 0,97 т п.н. Длина линейной ДНК, выделяемой из фаговых частиц, превышает размер генома на 10 т.п.н.
Из-за особенностей механизма !22 Часть 1. Генная инженерия ьн иео упаковки фаговой ДНК ее концы гомологичны (см. ниже). Благодаря ВесА-зависимой рекомбинации по участкам гомологии фаговая ДНК после инфицирования клегок циркуляризуегся, а затем регуляторной системой, сосгоящей из локусов иитС, !вин! и лнтТ, принимается решение о дальнейшем пути развития, литическом или лизогенном. Литическая репликация происходит сначала в тета-, а потом в сигма-формах. Упаковка Р1 геномов в головки ведется из конкатемсрной ДНК.
Реакция идет процессивно, начиная с рас-сайта (рас)саяе — упаковка), при этом из одного конкатемера "нарезается" 3 — 4 генома. Поскольку при каждом акте в головку упаковывается около 100 т.п.н., то последовательно упаковываемые молекулы ДНК имеют концевые повторы (избыточности) разного строения. Механизм упаковки не так строго специфичен, как у фа~ а 7,, поэтому в головку с частотой около 10-' может упаковаться любой фрагмент бактериальной ДНК. Это является причиной общей трансдукции, которую осуществляет фаг Р1.
Размер области еер, отвечающей за плазмидную репликацию, сравнительно невелик — 1,5 т.п.н. Ее строение и способ функционирования сходен с аналогичными данными лля плазмиды Г (см. рис. 3.7). Одинаково у этих плазмид устроены и области рае (ель рис. З.б и 4.10). Белки РагА и РагВ через сайт рае5, входящий в состав локуса !неВ, ведут распределение плазмидных ДНК по дочерним клеткам.
Фаг Р1 обладает также сайт-специфической рекомбиназой Сге, действующей через!охР-сайт и стабилизирующей плазмиду путем разрезания ее мультимеров. Имеется также система Р)к)/1)ос, обеспечивающая постсегрегационпую гибель клеток (см. гл. 3). Фаг Р1 и фаг-зранспозон Мп имеют одинаковый спектр клеток-хозяев. Как пример природной генной инженерии отметим выработанное ими свойство к расширению этого спектра, обусловленное врагцением областей С или 6 (у фага Мп) их геномов. Протяженность этих областей — около 4,2 (Р1) и 3 (Мп) т.п.н. Они ограничены инвертированными повторами, содержащими сайты действия (еьх и яьх) инвертаз, гены которых сьл (Р1) и «!и (Мп) находятся рядом с областями (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
