Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Интересно отметить„ что опины являются индукторами гга-оперона Т)-плазмид, способствуя их переносу в бесплазмидные клетки агробактерий. Существует несколько типов Т)-плазмид, отличающихся друг от друга структурой опинов, синтезируемых ими в растительных клетках.
Лучше всего изучены октопиновые и нопалиновые плазмиды, имеющие одинаковые сгроение (рис. 3.14,п). Октопиновые плазмнды содержат информацию о синтезе и расщеплении октопина и агропина, а нопалиновые — нопалина и агроцинопина. Гены синтетаз находятся в Т-ДНК, а гены, осушествляющие катаболизм этих опинов, — вне ее. Такое расположение генов синтеза и распада опинов соответствует их биологическому назначению: синтез опинов ведут опухолевые клетки, содержащие Т-ДН К, а их деградацию — клетки А.
гите~ас1елз, обладающие Т(-плазмидами. 92 Часть 1. Генная иллсенерия ьа гни о ы Г г-~~а®) яьв2 Рвсяты яаа «АФТИ Рис. ЗЛ4. Упрощенная карта Т)-плазмидА. лалеГааелг ~а) и схема переноса Т-ДНК из бактериальной клет- ки в растительную (б). Жирные стрелки — направление считывании генов; тонкие стрелки — поток химических сигналов и движение Т-ДН К„° — гранины Т-ДНК Глава 3.
Плазлшди 93 Т-ДНК ограничены несовершенными прямыми повторами, состоящими из 25 п.н. Для переноса Т-ДНК важен только его правый повтор; делеция левого повтора ведет к переносу всей плазмиды. Признак онкогенности обеспечивается двумя локусами: олс, располагающимся в Т-ДНК и содержащим гены онкогенности, а также иг, отвечающим за перенос Т-ДНК в растительные клетки. Локусы игу этих плазмид физически гомологичны и взаимозаменяемы.
Они включают около 25 генов, организованных в 7 оперонов (см. обзор %(паях, 1992). Гены игА и иЖ экспрессируются конститутивно. Белок-сенсор У)гА, интегрированный во внешнюю мембрану клеток, улавливает ацетосирингон и родственные фенольные производные, которые испускаются поврежденным растением, и передает об этом сигнал цитоплазматическому белку Ъ'1гО путем его Фосфорилирования (рис. 3.!4,б). Активированный белок У(гО является позитивным регулятором транскрипции других иг-генов.
Связываясь с их промоторами, он индуцирует их экспрессию. Оперон лгВ, состоящий из 11 генов, детерминирует образование трансмембранного мостика (поры) между бактериальной и растительной клетками. Далее эстафету принимают белки У(гГ)! и У(гГ32, которые вырезают нить Т-ДНК с правым 5'-концом, делая ники в прямых концевых повторах; вытесняемая нить покрывается при этом ЯВВ (з(пя1е-а!таис( б(пйпй) — белком Н)гЕ2. Белок У(г()2 ковалентно связывается с 5'-концом вытесненной нити и направляет ее через пору в растительное ядро.
Конечно, и в растительной, и в бактериальной клетках восстанавливается дуплексная форма Т-ДН К. В трансформированных растительных клетках Т-ДНК активно транскрибируется. мРН К Т-ДНК в растительных клетках устроены аналогично эукариотическим мРНК, т. е. на их 5'-концах находится 7-метил1уанозин, а на 3'-концах — сайты полиаденилирования ААУАА и полиадениловые цепочки. "Зукарнотической" особенностью транскрипционного механизма Т-ДНК является и отсутствие в ней оперонов„в то время как в других частях Т1-плазмид опероны есть. Эго пока единственный обнаруженный в природных условиях пример Функционирования прокариотической нуклеотидной последовательности в эукариотических организмах. Следует полагать, что функциональная часть Т-ДНК за 94 Часть 1.
Генная инженерия гн мин исключением механизма переноса эволюционно происходит из растений. Строение Т-ДНК и ее роль в образовании корончатых галлов у растений рассматриваются в гл. 12. Способностью трансформировать клетки двудольных растений обладают также некоторые плазмидосодержашие штаммы А. люеелез. У растений, зараженных этими бактериями, провоцируется образование ткани, которая получила название косматого корня. Поэтому плазмиды, вызывающие этот эффект, называхп К1-нлазмидами (гоог-1пЖс)пя). Генетические карты К(-плазмил схожи с таковыми Т1-плазмид. Оба типа плазмид физически гомологичны в области и(г, т.е.
эволюционная близость их несомненна. Инфекционной частью К1-плазмид также является Т-ДНК. Плазмиаы грамположительиых бактерий Эти плазмиды распадаются на две большие группы — мультикопийные и низкокопийные. Первые характеризуются небольшим размером (несколько т.п.н.), репликацией по механизму катящегося кольца, способностью к мобилизации, широким кругом хозяев (некоторые из них могут поддерживаться даже в грамотрицательных клетках). Прототипом может служить плазмида р()В!10 (4548 п.н.), выделенная из Яарйу(ссоссцт ангеля.
Она содержит маркеры устойчивости к неомицину (нео) и флеомипину ((И), покус тоЬ (мобилизация), ген герс) (инициатор репликации), в начальной части которого расгюложен локус 1лсА, ответственный за несовместимость плазмид, и два ог1-сайта (рис. 3.15). Сайт ь(ю (с1опйе-а1гапг1 опя)п) предназначен для инициации репликации в лвунитевой форме, а язо (з(пя1е-в1гапь( опя(п) — в однонитевой. Белок Кер13, имеющий топоизомеразную активность, распознает сайт гЬо на суперскрученной ДНК, делает в нем ник, связывается ковалентно с 5'-концом разорванной нити и после полного вытеснения этой нити замыкает ее в однонитевое кольцо.
Здесь на сайте яю инициируется раунд репликации, завершающийся образованием двунитевой плазмидной копии. Вторая молекула плазмилной ДНК образуется в процессе копирования "катящейся** нити. Оба репликативных процесса идут по лилирующей нити, что существенно сокращает их потребность в репликационных ферментах. Глава 3. Плазнидм 95 Плазмнла рЬ В1! О использует бактериальные ДНК-полимеразы П1 и Ро!1, гсликазу, лигазу и ББВ-белок. Эти белки есть в любой клетке, по и объясняет возможность плазмиды использовать ши- рокий круг хозяев. ° я-- - юпоь кап~~ м! и!, ~яв ~ ! скося 1~ хо." гнккпяяеразн ~ 3 У Ра! Ш.
Ро! ! герц дПК- опон Рнс 3.15. Строение плазмнды рЬВ110 н схема сс рсплнкацнн по механизму катящегося кольца. Стрелки у карты плазмнды — направление считывания генов; стрелки в оп(-сайтвх — направление одноннтсвой (ззо) н двунитсвой (озо) рсплнкацнн; штрихи -- сннтсзнрусмая нить ДНК. Обозначения н пояснения даны в тексте Ре!уляция числа плазмидных копий происходит путем поддержания концентрации белка Кер() на определенном уровне. Это осуществляется тремя путями.
Во-первых, асРНК, комплементарная начальной части мРНК гена гср(1 подавляет ее трансляцию. Вовторых, в конце каждого раунда репликации белок КерБ теряет топоизомеразную активность и переходит в Форму Кер()*, не способную инициировать репликацию. В-третьих, димер Кер1) — Кер()* связывается с сайтом г(зо, препятствуя интактным белкам начать реш!икацию.
В геномах мультикопийных плазмнд, представляющих другие семейства (рЕ194, рТ181 и др.), блоки генов, которые отвечают за репликацию, устойчивость к антибиотикам и мобилизацию, расположены сходным образом. Механизм репликацин и механизм контроля репликации этих плазмид отличаются лишь деталями. Некоторые плазмиды имеют расширенный круг хозяев — они развиваются как в грамположительных, так и в грамотрнцательных клетках.
Плазмида рС194 нз Х аигеиз является своеобразным 96 Часть !. Генная инженерия гн лте "чемпионом'* и этом отношении — она может реплицироваться даже в клетках низших эукариот — дрожжах (Оопгаог ег а/., 1982). Свойства низкокопийных плазмид сходны со свойствами по- лобных плазмид грамотрицательных бактерий.
Они реплицируются в тета-форме и содержат локусы, поддерживающие их стабильное существование в клетках. Некоторые из них являются конъюгативными. Ливейвые плазмвды Полная репликация линейных молекул ДНК обеспечивается благодаря специфической структуре их концов, называемых тело- мерами. Этот термин был введен для обозначения концов хромосом у эукариот, а после открытия линейных плазмид стал применяться и для названия их концов.
У линейных плазмид известно два типа теломер — открытые концы и ковалентно замкнутые (закрытые), но в обоих случаях концевые структуры представлены инвертированными повторами. Первый тип характеризуется присутствием концевого белка, ковалентно соединенного с 5'-концом каждой нити (см. рис. 3.1,б), а второй — наличием на обоих концах шпильки, замыкающей ковалентно обе нити ДНК (см. рис.
3.1„в). Линейные плазмиды с первым типом теломер были впервые выявлены у почвенных бактерий Ягерштусея, а затем были найдены в цитоплазме, митохонлриях и хлоропластах многих эукариотических клеток — грибов, водорослей и высших растений. Такие теломеры имеются также у некоторых бактери альных и животных вирусов (см. обзор Н)ппеЬпасЬ, Т11!у, 1991). Именно с их помощью был выяснен механизм репликации ДНК этого типа и выявлена праймируюшая роль концевого белка в этом процессе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
