Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Июпеграции. Плазмиды со строгим контролел1 репл икании способны к интеграции в бактериальную хромосому через 1б- или Тп-элементы„содержащиеся в их геноме. При этом они подчиняются репликапионному аппарату бактериальной хромосомы и могут неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазмиды с двойным "образом жизни" получили название аписом (например, нлазмида Р). Каиаюгация. Свойством многих плазмид является их способность передавать свою копию в другие клетки методом коньюгации. Плазл1иды, обладающие этим свойством„называют конъюгативными, или трансмиссибельными; они содержат в своем геноме оперон !га. Этот оперон обеспечивает образование конъюгационного мостика между клетками, по которому может переноситься одна из нитей плазмидной или бактериальной ДНК. Он вызывает также появление у клеток пилей (волосков) определенного типа„ способных аасорбировать специфические фаги.
Конъюгативные плазмиды свойственны, главным образом, грамотрицательным бактериям. Они, как правило, имеют довольно ограниченное число клеток-хозяев, в которые могут переносить и реплицировать свою ДНК. Но среди ннх есть плазмиды и с широким кругом клеток-хозяев. Например, плазмида КР4, выделенная из бактерий /Ъеиг!огпоназ, переносится и стабильно поддерживается в грамотри цательных клетках АвгоЬасгегГиен, АсогоЬаггег, ЕгютГа, К(еЬзуе!!а, Езсйепсйга, КЬГгоЬгит, ййое!оряеие!отоназ, 5а!толе/(а, ЗЬ(де!(а и др. Следует подчеркнуть, что такой канал переноса генов между различными видами и родами бактерий способствует адаптапии клеток к изменяющимся условиям.
Мобияизииил. Многие неконыогативные плазмиды обладают свойством мобилизации, т. е. способностью переноситься в другие Глава 3. Плазмш)ы 69 клетки с помощью коньюгативной плазмиды. У таких плазмид имеется специальный покус, обеспечивающий передачу их ДНК через '"чужой" конъюгативный мостик (мобилизация ьч лалз). Возможен и другой путь. Наличие транспозонов в плазмицах способствует их объединению друг с другом, т.
е. образованию коингегратов. Неконъюгативная плазмида может быль перенесена в другую клетку в составе коинтеграта с конъюгативной плазмидой (мобилизация ш сй). Коинтеграты в реципиентных клетках распадаются на исходные репликоны, которые продолжают автономное сук цествование. Несовместимость. Если плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке в условиях отсутствия селективного давления, их называют несовместимыми. Несовместимость плазмиц обусловливается подавлением репликации одной из них и (или) блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением.
Эги оба механизма действуют независимо друг от друга. Несовместимость, вызванная подавлением репликации, наблюдается у плазмил как со строгим, так и с ослабленным контролем репликации. Она обусловлена существованием у плазмид генетического механизма поддержания числа плазмидных копий на определенном уровне, который приводит к тому, что в клетке только одна из двух плазмид (резидентная или с меньшей вероятностью вошедшая) сохраняет способность к удвоению. Несовместимость, вызванная блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам, характерна для низкокопийных плазмид. В ее основе лежит факт конкуренции плазмид за сайты на цитоплазматической мембране, обеспечиваюгцие их распределение при делении клеток.
Тест на совместимость позволяет разделять плазмиды на группы несовместимости (табл. 3.1). У Е. со11 их насчитывается более 30. Плазмиды, входягцие в одну группу, несовместимы, т. е. исключают друг друга. Несовместимыми могут быть и плазмиды с разным фенотипическим проявлением. Например, в группу Г1 входят плазмиды типа Е (половой фактор), Со! (колициногенность) и К (устойчивость к антибиотикам). Поверхностное исключение. На практике определение групп несовместимости осложняется явлением поверхностного исключения (зпг(асе ехс!пяоп), свойственным конъюгативным плазмицам.
70 Часть ц Геолал илвсенерил!и мто дело в том, что если в рсциписнтной клетке уже имеется конъюгативная плазмнла, то при конъюыции с ней другая плазмидная ДНК проходит через клеточную оболочку с трудом. Частота переноса плазмид при этом падает в ) Π— ! ОО раз по сравнению с таковой в бссплазмнлныс клетки. Плазмиды, преодолевшие этот барьер, стабильно сосуществуют с плазмидой-рсзидснтом, если они, конечно, совмссгимы. Таблица ЗД Коныогативные пллзмиды Е соИ, используемые в тестах на несовмеспвиость Стабильность. Как и всего живого„главное в "жизни" плазмид — это обеспечение своего стабильного существования.
Для этого в процессе эволюции у них выработалось несколько механизмов: надежный контроль числа копий, точное распределение плазмидных ДН К по дочерним клеткам, разрсгпснис коинтсгратов и ностсегрсгационная гибель бесплазмидных клеток (см.
обзор )чогсМгош, Ацзбп, 1989). Контр оп ь числа копий осуществляет базовый рспликон плазмиды (его размер около 2 — 3 т.п.н.), в который входят сайт начала репликации оп', сайты контроля за копийностыо сор и несовместимостью ьчг ()псогпрайЬ|йГу), а также гены, чьи продукты функционируют на этих сайтах.
По механизму контроля процесса Глава 3. Плазмиды 7! репликации базовые репликоны делятся надва типа. В олних репликонах контроль осуществляется с помощью асРНКлибо науровне праймера регшикации в оп'-сайте (например, плазмида с ослабленным контролем репликации Со!Е1), либо на уровне транскрипта репликационно~ о гена (например, плазмцда со строгим контролем реял икации К! ). В репликонах другого типа контролирующий белок выполняет свою функцию, взаимодействуя с итеронами, присутствующими в сайтах сор и глс (например, плазмиды со строгим контролем репликации Е и Р1).
В обоих случаях контролирующий механизм поддерживает заданное число копий плазмиды в клетке. Если, например, в клетке оказались две родственные малокопийныс плазмиды, то механизм контроля замечает наличие двух гомо- логичных окдсайтов и разрешает только завершение уже начатого раунда репликации, блокируя инициацию нового.
В этом и состоит причина несовместимости таких плазмид. Термочувствительные мутации в сайте сор позволяют в условиях эксперимента ре~ улировать число копий плазм ил, имеющих строгий или ослабленный контроль процесса репликации. В ряде случаев полезны мутации (их называют тип-аиду), приводягцие при 42 С к синтезу более 2000 копий плазмид на клетку и вызывающие гибель клеток (см.
гл. 10). Механизм распределения плазмидных ДНК по д о ч е р н и м к л е т к а м, как уже отмечалось, является ешс одной причиной несовместимости у малокопийных плазмид. Необходимость такого механизма для этих плазмид очевидна, так как вероятность их потери при случайном распределении по делящимся клеткам очень велика. Сегрегация бесплазмидных клеток ведет к их накапливанию в клеточной популяции из-за большей скорости их удвоения по сравнению с клетками, содержащими плазмиды.
Еще более сложна эта проблема для бактериальных клеток. У них выработался специальный механизм ее решения (см. обзор Н!гада, ! 992), суть которого заключается в связывании дочерних ДНК с помощью спсциалыюго белка со специфическими сайтами на цитоплазматической мембране, направляющими расхожление ДНК при делении клеток. Сходный механизм используют и плазмиды, но у них для этого есть собственные белки Раг (рагб!!оп) и свой сайт на мембране, а также предназначенный для связывания сайт на плазмидной ДНК (рис. 3.3). Предполагается, 72 Часгь К тснинл инженерил ьл иво что для белков Раг определенной нлазмилы на мембране имеется только один сайт, поэтолту с ним может связаться лишь одна пара разделяюшихся молекул ДНК.
Следовательно, плазмиды, имеюшие одинаковые или сходные гены раб несовместимы. Релликациа Завершение р:нлнкации 4 Расхождение нллхнил Рост селтуиа Ф Клеточное деление Рнс. 3.3. Механизм распределения плазмид по дочерним клеткам. Жирной линиеи выделен гипотетический сайт на цитоплазматичеекой мембране, к которому прикрепля- ются плазмиды с помощью Раг-белков Мультикопийные плазмиды распределякггся по дочерним клеткам случайным образом.
Казалось, это не должно вызывать серьезных проблем, так как уже при числе копий более 10 вероятность сегрегации бесплазмидных клеток менее 10 '. Однако известно, что у цлазмид благодаря гомологической рекомбинации могут образовываться коинтеграты, содержащие несколько плазмидных геномов. Это свойство плазмид приводит к уменьшению числа плазмидных репли- Глава 3. 77лазмидм 73 конов в клетке и грозит вызвать их дестабилизацию. В данном случае стабильность плазмид поддсрживастся м с ха н и з м о м р аз р е— ш е н и я ко и н те гр а то в. Он обеспечивается сайт-специфической рекомбипацией между геномами, входяшими в коинтеграты, в результате чего они распадаются на моногеномные репликоны (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
