Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Механизм коныог.апии между цонорной и реципиентной клеткой (КогпЬегв, Ва)гег, !992) Образоваиие г" гьгаъиид. Другим примером природной ~енной инженерии служит процесс образования Е'-г!лазмид, т. е. Е-плазмид, содержащих бактериальные гены. Эти плазмиды образуются при случайном неправилыюм исключении интегрированной Е-плазмиды из бактериальной хромосомы. Образование Г-плазмиды в результате внугримолекулярной рекомбинации, происходяцгей по флангам интегрированной плазмиды иллюстрирует рис.
3.9,в,г. В этом случае Е'-плазмида не повреждается и сохраняет конъюгативные свойства. В таких плазмидах бактериальная и плазмидная Д1-! К разделяются прямыми повторами 1В-элемеггтов. Если при вычленении Г-г!лазмиды из бактериальной хромосомы оперон гга делетируется хотя бы частично, образовавшаяся Е'-плазмида будет некоцъюгативной.
В любом случае Г-плазмидадля сохранения репликонных свойств должна содержать область гер. Первой 80 Часть 1. Генная инженерия 1л ггп а найденной Г-плазьгидой была плазмида Г 1ас. С ее помощью была образована коллекция Н1г-клеток серии ЕС (см. рис. 3.10). 1 4'В А,ою ич Й Й~ с Й Ф го о Рис. 3.9. Механизм образования клеток НГН3 и плазмиды Р13: а — Р-плазмггда; б — 1ас-участок бактериальной хромосомы; в — тот жс участок с интегрированной через 132-элемент г-плазмидой; г — плазмила г" 13.
образованная при неправильном исключении г-плазхгилы из хромг сомы клеток Н1г13. Стрелка в оиТ вЂ” направление переноса ДНК при конъюга- нии; пяазмидная ДНК выделена двойной линией Глава 3. Плазмоды 81 ФЫ7,' Ф-;!28 -;-' ': АА.*" рве( ".' Пв ч 152 хм 5 " отпг чв орр оо, вв зл.:- Я 11 яро йм ряс пв. 1кй рва гара рв В7 ео,l 1 1 '(1 ~~ ) ',~(1е . ВС28 .,Г81 16 У ~ )Ь Рис. 3.10.
Гене~ические карты Е. сов К-12 (внутреннее кольцо), НГгштаммов, образованных интеграцией Р-плазмиды (среднее кольцо), НГгштаммов, образованных интеграцией Гг(ас-плззмиды (внешнее кольцо) и Рчплазмид (внешние сегменты). Указаны названия генов и штаммов. Стрелки у среднего и внешнего колец — направление передачи хромосомы; стрелки внешних сегментов— направление в них опТ-саггга; С 3 — делеция. Нумерация внешних сегментов соответствует названиям Е'-плазмид, а размер — переносимому участку бактериальной хромосомы.
Координаты даны в минутах. По Но((отгау, (.озч, ! 987; Шпег(а, 0)явибо, 1989 Частота спонтанного образования г '-плазмид из клеток НГг не превышает 10-'. Поэтому было разработано несколько методов 82 Часть 1. Генлпя иижеяерлл гл ию их селективного выделения, одним из которых является метод Лоу. Он сводип:я к осугцествлению конъюгации клеток Н)г, у которых Г-плазмида локализуется рядом с нужным геном, с клетками ГтесА „содержащими необходимые для селекции Г'-плазмид мутации. При этом в некоторых реципиентных клетках благодаря наличию генов Г-плазмиды в донорном фрагменте хромосомы происходит его превращение в самостоятельный репликон.
Клетки с нужными репликонами (Г'-цлазмидами) отыскиваются на селективных средах, причем мутация гесА исключает отбор рекомбинантов. Подобным образом была создана коллекция Г-плазмид, перекрывающих всю хромосому клеток Е. сой (см. рис. 3.10). Разработан и более универсальный метод получения плазмид, содержащих бактериальные гены. Он предусматривает использование фага Мв. При вегетативном развитии этого фага в клетке образуются гетерогенные колытевые молекулы длиной до 150 т.п.н., включающие фрагменты бактериальной ДНК и хромосому фага. Если в клетке в момент инфекции фагом или индукции профага присутствует конъюгативная плазмида, находящаяся в автономном или интегрированном состоянии, то она может образовать коинтеграт с гетерогенной кольцевой молекулой ДНК, представляющий собой Г'-плазмиду.
Эту плазмиду сохраняют путем коньюгации гибнущих клеток с клетками ГтесА-. С помощью данного метода получают Г'-плазмиды, несущие любые комбинации бактериальных генов, так как коинтеграт может состоять из нескольких гетерогенных кольцевых молекул ДНК. Перенос бактериального фрагмента ДНК кон ьюгативной плазмидой возможен и в том случае, когда между ними нет стабильной связи. Например, Г-плазмила при конъюгации переносит с частотой около 10 ' любой бактериальный ген в реципиентную клетку, где он интегрируется в ДНК реципиента с помощью КесА-зависимой рекомбинации и в плазмиде не присутствует. Это явление, получившее название мобилизации хромосомы, осуществляется благодаря КесГ-зависимой рекомбинации. К-плазмиды Рассмотрим только К-плазмиды группы несовместимости 1псГП.
Из данной группы наиболее изучены конъюгативные плаз- Глава 3. !!лазмиди 83 миды со строгим контролем репликации — К! и К100, размер которых около 90 т.п.п. Первоначально они были изолированы из клеток ЯлхеПа, но легко переносятся и поддерживаются в клетках ЕзслепсЫа, К!еЫеИл, Ргогеиз и Яи!топеИа. Геномы их устроены сходным образом, что позволяет составить обобщенную генетическую карту этих плазмид (рис. 3.11). Обе плазмиды относятся к классу плазмид с множественной лекарственной устойчивостью и содержат гены, определяющие резистентность клеток к хлорамфениколу, стрептомицину, спектиномицину, сульфаниламидам и фузидовой кислоте. Кроме того, плазмида К1 несет летерминанты устойчивости к капамицину и ампициллину, а плазмида К!00 — к тетрациклину и ионам ртути. Эти гены входят в состав различных транспозонов и почти все располагаются в одной области (г-Нег), ограниченной прямыми повторами !Б!-элементов, которая у плазмиды К!00 представляет собой транспозон Тп 267 !.
Благодаря этому область г-ИеГ может переноситься в другие плазмиды. Вторая часть К-плазмид, называемая КТГ (гез!згапсе ггапз(ег бас1ог), может быль самостоятельной конъюгативной плазмидой, содержащей ген Тс". Локализуюшийся в ней гги-оперон обладает 90%-ной гомологией с гги-опероном Р-плазмиды. (Это еше раз подчеркивает роль прирсщных генно-инженерных операции: некогда найденная удачная комбинация генов переносится блоком в ДНК друг их объектов и используется там в том же качестве.) В этой же части располагаются гены и сайты, отвечающие за репликацию (герА) и несовместимость (!лсА) плазмид, а также за постсегре~ационную гибель бесплазмидных клеток (рагО).
Контроль числа копий у плазмид К1 и К!00 осуществляется так же, как и у плазмид Р, Р1 и РЯС!01, путем поддержания концентрации белка КерА па заданном уровне с помощью связывания этого белка с итеронами, находящимися в сайтах !лс (см. рис. 3.7). Однако в данном случае контроль транскрипции гена герА, имеюшего два промотора, ведет локус сор.
Дальний промотор. кроме синтеза белка КерА, обеспечивает еше и синтез белка СорВ, являющегося репрессором транскрипции с ближнего промотора. А транскрипт гена сорА осушествляет дополнителызый контроль, действуя как антисмысловая РНК против обоих мРНК. Баланс всех этих реакций и приводит к строгому контролю репликации К-плазмид. 34 Часть 1. Генная инаеенерия гн тово Рис. 3.
! !. Строение К-гпазмид группы несовместимости 1псР!1: а — обобщенная карта; б — плазмида ИОО; в — плазмида И. Стрелки над 1й-элементами обозначают их ориентацию; стрелка в олТ вЂ” направление переноса ДНК при коныогации; пунктир— делецию Локус згб, отвечающий за распределение плазмид К! и К!00 по дочерним клеткам, организован так же, как и раг-локус плазмид Р и Р1 (см. рис. З.б).
Имеется у них также и механизм посгсегрегационной гибели бесплазмидных клеток, представленный генами Ьо)с (мозг И1!пя) и зо/е (зцрргеззог оу йо!е). Здесь противоядием является нестойкий негранслируемый транскрипт гена ао/е, действующий как асРНК против мРНК гена Ьо!е. Образующийся дуплекс разрушает- Глава 3. Плазмиди 85 ся РНКазой П1, что уберегает клетки от гибели, пока в них есть плазмида. Еше одна система стабилизации плазмид К1 и К100 расположена в покусе ригР, содержащем гены /сЫ ((п(11)пя с1егегпйпапг) и (оз ()п1 йпл зпрргезв(оп).
Мишенью белка Кк( является репликационная геликаза РпаВ, что в бесплазмидных клетках ведет к остановке синтеза ДНК и ингибированию клеточного деления. Большое количество транспозонов в плазмидах группы 1псР П обусловливает нестабильность последних в некоторых видах клеток. Например, гпазмиды, перенесенные из клеток Е. соЬ' К-12 в клетки Ргогеиз алга(л2ц, распадаются на части, содержащие элементы КТР с интегрированными в них теми или иными транспозонами.
Благодаря подвижности транспозонов плазмиды, обладающие множественной лекарственной устойчивостью, могут вычленять близкие им по свойствам дочерние плазмиды, образуя тем самым целые семейства. Плазмиды, входящие в состав одного семейства, отличаются комбинациями маркеров устойчивости к антибиотикам. Именно такое семейство составляют плазмиды группы несовместимости 1псР П. Плазмида Со)Е1 Эга неконъюгативная плазмида Е.
со((относится к классу плазмид с ослабленным контролем репликации. Размер плазмиды Со1Е1 6,65 т.п.н., число копий на клетку — около 20. Ее ген сел определяет сигпез колицина Е1, вызывающего деполяризацию цитоплазматической мембраны и гибель клеток. Плазмидный ген иит обеспечивает клетке иммунитет к действию этого колицина. Синтез колицина в норме репрессирован, но индуцируется агентами, влияющими на метаболизм ДНК. Локус плазмиды Со!Е1, ответственный за репликацию, расположен около опЧ-сайта, с которого начинается однонаправленная репликация плазмиды (рис.
3.12), целиком зависящая от бактериальных белков. В нем имеется два промотора, с одного из которых в направлении к оп'-сайзу стартует транскрипт РНК П, терминирующийся после прохождения ого'-сайта. Известно, что по мере синтеза нить мРНК вытесняется из транскрипционной петли (К-петли) самой РНК-полимеразой. РНК П также вытесняется по всей своей длине, кроме области, комплементарной Зб Часть 1. Генная ннаеенерня гн и хо огйсайту, где благодаря специфике нуклеотидной последовательности дуплекс ДНК вЂ” РНК, образовавшийся в процессе транскрипции, не разрушается. Такие дуплексы распознаются РНКазой Н, которая гидролизует в них РНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
