Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 12
Текст из файла (страница 12)
!'!сключение транспозона из хромосомы редко происходит с восстановлением прежней последовательности нуклеотилов. Если этот процесс сопровождается потерей или приобретением нуклеотидов без нарушения рамки считывания гена, то это ведет к появлению новой изо-формы белка, что может иметь селекгивные преимушества. Перенос генов.
Наиболее ярким проявлением природной функции бакчериальных транспозонов является перенос ими генов, тем более что переносятся, главным образом, гены, определяющие устойчивость клеток к различным антнметаболитам. Правда, этот перенос, если не считать конъюгативных транспозонов, осушествляется только изугри клетки Но именно благодаря ему данные гены включаются в плазмиды и вместе с ними распростраггяются в популяциях клеток разных видов, изменяя их способность к выживанию в неблагоприятных условиях.
Конъюгативные транспозоны выполняют эту функци~о самостоятельно. Например, первый найденный у энтеробактерий конъюгативный транспозон СТмсг 94 переносит локус зсб который придает клеткам способность использовать сахарозу как единственный источник углерода (НосЫтц! ег а1, ! 997). Транспозоны могут интегрироваться друг в друга, образуя рекомбинантные мобильные элементы (комбинации Тп и 1К) с разными наборами генов-маркеров (см., например, рис. 3.11). Что же касается способов приобретения самими транспозонами таких генов в процессе эволюции, то они были, по-видимому, многообразными. Один из них стал понятным после открытия и изучения интегронов.
Глава 2. Траисиозоиы 59 шй рр м|ЩВА ~:.Е.=,.=Я:~~:::: 5 „Са аа! мц ~р аавз йи)вА ) ~~.с ъ — Б7еххе~ --ь:~ 5'-Оа ащ ИНЗ Ф. !аа р+ Ганыаа кассета еаА 3'! янз у-св Ф. 5-Са ац! Рис. 2.!О. Схема строеапи и функционирования ннтегронов: а„ б, в — гипотетическая схема образования транспозона-интегрона Тп402 путем "захвата" им гена фгВЗ; а — интегрон без генной кассеты; б — генная кассета; в — Тв402; г — интсцюн, неспособный к самостоятельному перемещению. С5 — консервативная последовательность; р — промотор; ии1 — ген интегразы; ФВЗ вЂ” ген устойчивости к триметоприму; а — инициирующий колон; 4 — терминирующий колон„° — ан1-сайт; о — сайт КН3; затемненный дуплекс — беспромоторный аеп; стрелки на концах ннтецюна — инвертиро- ванные повторы из 25 п.н.
Интегронами называют специфические генетические элементы, содержащие в своем составе интеграционный модуль— ген интегразы 1и(1, правосторонний промотор и сайт интеграции и!11 (рис. 2.10). Благодаря модулю они способны захватывать, экспрессировать и перемещать генные кассеты. Последние представляют собой„как правило, беспромоторные гены устойчивости к а!и ибиотикам, содержащие рекомбинационный сайт ЯНо (тесов!!5!па!1оп по! яро!).
Такие гены обнаружены в плазмидах многих клинических изолятов грамотрицательных бактерий. бО Часть!. Генная инженення 1и ееев Первый интегрон был найлен в транспозоне Тп21 (Вгокез, НаП, 1989), затем они были идентифицированы в других трансиозонах и илазмилах. Анализ интегронов показал, что они являются дефектными производными транспозона Тп402, имеющего инте!рациоиный модуль. Перенос этого транспозона обеспечивается оиероном гн!АВОК н инвертированными концевыми повторами, состоящими из 25 п.н.
Гипотетический механизм "приобретения*' им гена устойчивости к триметопрнму сугВЗ представлен на рис. 2.10,а,б,в. Выявленные к настоящему времени интегроны содержат постоянный 5'-сегмент (5'СЯ) с геном интегразы ам1, иравосторонним промотором и сайтом интеграции ап1 (рис. 2.! О,г). 3'-сегмент (3'СБ) содержит фрагменты пи'-оперона разной длины, один или два 18-элемента, а завершается он инвертированным повтором из 25 п.н. Между ними закнючен вариабельный сегмент с каким-либо бесиромоторным геном устойчивости к антибиотику; такие гены экспрессируются только с помощью промотора 5'- сегмента. Из-за дефекгности гп1-оперона интегроны не могут перемещаться самостоятельно, но в присутствии транспозона Тп402 или родственного ему (по функции транспозиции) транспозона Тп5053 их перенос возможен (КЬо(обй ег а1., 1995).
В 3 '-конце вариабельного сегмента имеется сайт !1НХ Интеграза интегронов способна с высокой вероятностью осуществлять сайт-специфическую рекомбинацию между сайтами агг1 и НН5 или между двумя сайтами 11НХ Благодаря этому вариабельные сегменты могут вычлениться в кольцевой форме и перемещаться в другие ннтегроны. Подобные генные кассеты мокнут интегрироваться с низкой вероятностью и во впзричные ап1-сайты, встречающиеся в бактериальных и плазмидных геномах. В этом плане инте!раза интегронов похожа на инте!разу фага Л (см. гл.
4), Она способна также образовывать коинтеграты из плазмид, содержащих интегроны, и обьелинять мобильные генные кассеты. Происхождение генных кассет неясно. Полагают, что они являются результатом обратной транскрипции определенных мРНК, что обьясняет отсутствие у них прима!оров (см. обзор На!1, Со(!!з, 1995). Интересно также отметить, что некоторые интроны генов органелл ведут себя как подвижные генетические элементы (см. обзор 1 ап!Ьовйг, Ве!Гог1, ! 993).
Такие интроны солержат открытую рам- Глава 2. Трансноаоны 6! ку считывания. Белки, кодируемые интронами группы 1, имеют гомологию с сайт-специфическими эндонуклеазами. Предполагается, что эти белки при участии рекомбиназ обеспечивают перенос копии интрона в безынтронный ген того же семейства. Интроны группы П содержат информацию о белках, обладающих значительным сходством с обратными транскриптазами.
Возможно, они образуют ДНК-копии вырезанных интронов, которые затем внедряются в разные участки ДНК органелл. Рекяия на слтреее. Следует отметить реакцию некоторых транспозонов на стрессовые для клетки ситуации, которая способствует их совместной выживаемости. Например, частота транспозиции транспозопа Тп50! сушественно увеличивается при наличии в среде ртути, а транспозона Тп551 — в присутствии эритромицина. Отмечено увеличение частоты транспозиции ретронозона Ту при обработке дрожжевых клеток определенными мутагенами. О роли транспозонов в эволюции геномов уже упоминалось.
Согласно Хесину 11934), транспозоны являются агентами, осуществляющими связь между геномами всех организмов. Поэтому, по его предположению, генофонды всех организмов объединены в обгций генофонд всего живого мира. ПРИМЕНЕНИИ ТРАНСПОЗОНОВ Транспозоны, в том числе и фаг Ми, нашли широкое применение в молекулярной генетике. Прежде всего следует отметить, что они могут служить мутагенами. Чаше лля этого используют транспозон Тп5. Причин для этого несколько. 1. Он слабо специфичен к сайтам интеграции, и поэтому легко переносится в хромосому, а также во внехромосомные элементы.
2. При его транс- позиции низка вероятность геномных перестроек. 3. Он стабильно поддерживается в интегрированном состоянии. 4. Он способен к транспозиции во многих видах грамотрицательных клеток. Транспозоны Тп1 и ТпЗ перемещаются главным образом в плазмиды. Перенос их в небольшие плазмиды происходит без дополнительных эффектов, в то время как интеграция в крупные плазмиды часто сопровождается делециями соседних областей плазмидной ДНК. Следует отметить, что для мутагенеза используют не сами транспозоны, а их варианты, полученные рл и!го и 62 Часть 1. Генная инженерия и илаа солержащие разнсюбразные селективные маркеры. Из таких вариантов наименьшим цо размеру является Тп5знрЕ (2б4 н.н.), предназначенный для мутирования и секвенирования генов, клонированных с помощью Фа| а Л (см.
гл. 9). Чтобы вызвать мутации в Фагах, их пассируют в клетках, содержащих транспозон-мутаген. Мутантные фаги находят в полу челном Фаголизате, инфицируя Фагами подходящие тестсрные штаммы. Например, при использовании транспозона Тп5зирЕ инсерционные мутанты фага Л легко выделяются но их росту в клетках Е. соб зир', если исходный Фаг содержал амбер-мутации (Рладп)з ег а1., 1989).
Плазмилы, предназначенные лля мутирования, вводят в транспозон-содержащие клетки, а затем переносят в другие клетки и находят бактерии с фенотипом, который определяется мутируюшим транспозоном. Перенос плазмидной ДНК осуществляют с помощью трансформации или методом конъюгации (в случае конъюгативных нлазмид, см. гл. 3). Если транспозонмутаген исходно находится в плазмиде, то плазмида-донор должна иметь условнолетальный дефект по репликации либо быть просто неспособной реплицироваться в данн ~ виде клеток. Это необходимо, чтобы в процессе поиска мутагн и ых плазмид в селективных условиях сохранились лишь клетки с теми реципиентными нлазмилами, в которые интегрировался транснозон, Сайты внедрения транснозонов можно картировать с помощью электронной микроскопии гетеродуплексных молекул ДНК, но су1пественно проще это делать методом рестрикционного анализа (см.
гл. 8). Транспозоны используют и с целью создания в нужных местах ДНК областей гомологии для КесА-зависимой рекомбинации, а также для внесения подходящих сайтов рестрикции (см. гл. 6) с целью дальнейших генетических манипуляций ьн игго. Свойство ДНК Фаш Мц образовывать коинтеграты используют для переноса генов и конструирования (л ию рекомбинантных плазмид. С помоною этого Фага осуществляют, например, интеграцию кольцевых генетических элементов (фаговые или плазмидные ДНК) в бактериальную хромосому по механизму, представленному на рис. 2.2.
В таких случаях интегрированный элемент оказывается Фланкированным двумя профагами Мц. Для переноса генов особенно удобны мини-Мц фаги (Вез(бо(а ег а1., 1981). Так называют фаги Мц, у которых после Глава 2. Гоанснозонм 63 операций ьл тгио (или ьл и!го) утрачиваются литические функции (см. рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
