Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Их роль ясна из их названия. Глава!. Гены 31 Регуляция. Особенностью транскрипционного аппарата эукариотических клеток является наличие в ДНК специфических локусов — энхансеров (епйапсег — усилитель). Они участвуют в регуляции активности генов, увеличивая эффективность транскрипции ближайшего гена в десятки и сотни раз. При этом энхансер может находиться в любой ориентации по отношению к гену, располагаться с лк>бой его стороны, внутри его (в интроне) и даже на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов. По многим своим свойствам, в частности по мозаичности строения, энхансеры напоминают дополнительные части промоторов, но только расположенные в стороне.
Сходство усиливается и тем, что некоторые элементы (боксы) мозаики промоторов и знхансеров одинаковы, а также тем, что специфика регуляции экспрессии генов определяется элементами и/или промоторов, и/или энхансеров. По способу регуляции экспрессии генов различают два типа знхансеров.
Инлуцибельные энхансеры реагируют на изменения в окружающей среде (тепловой шок, вирусная инфекция, появление тяжелых металлов, ростовых факторов, стероидов и т. п.). Такие знхансеры есть у генов белков теплового шока, металлотионина, р — интерферона, некоторых онкогенов и лр. Т к ан ее пецифичные и временные энхансеры активны только в определенных клетках или в определенное время развития организма (например, энхансеры генов иммуноглобулинов). Механизм работы энхансеров заключается в посадке на них специфичных белков, которые за счет образования петель в ДНК взаимодействуют с транскрипционными факторами, связанными с промотором ближайшего гена, увеличивая тем самым число посадок на него РНК-полимеразы П. Г1о-видимому, также работают и локусы с противоположным эффектом действия — сайленсеры (зйепсег — успокоитель), в присутствии которых транскрипционная активность РНК-полимеразы П уменьшается.
У дрожжей аналогами знхансеров и сайленсеров являются последовательности ПКб и Г)АБ (см. рис. 1.8,б). Таким образом, механизм регуляции транскрипции у эукариот более гибкий, чем у прокариот. Фиксированная химическая структура прокариотических промоторов более приспособлена для ре- 32 Часть !. Генная нняеенерия Гн пео гуляции по принципу "все или ничего", в то время как мозаичность строения эукариотических промоторов совместно со своиствами энхансеров позволяют осугцестьлять нюансированную регуляцию — от полной экспрессии до полной репрессии, что достигается путем локальной модификации ДНК, изменением внутриклеточных условий и т. д. Формирование традсеерилта.
Транскрипция генов у эукариот происходит в ядрах, что приводит к образованию РНК- предшественников (пре-мРНК). Уже на начальном этапе синтеза к их 5 '-концам через связь 5' — 5' присоединяется необычное основание (сар) — ?-метилгуанозин. Этот процесс называется кзппированием (сарр1пе). При рассмотрении механизма термипации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой П, следует различать два пропесса — окончание синтеза транскриптов и образование 3'-конца мРНК.
О первом процессе известно пока немного. Обрыв транскрипции каждого индивидуального гена детерминирован, но чем он определяется неясно. Возможно, какое-то значение имеет отмеченное во многих случаях обогащение конца генов тимидиновыми остатками. Во втором процессе ключевую роль шрает гексамер АЛ()ААА, находящийся в транскрипте на расстоянии около 20 п.н. от сайта полиаденилирования. Гексамер распознается фактором специфичности, работающим в комплексе со специализированной эндонуклеазой и поли(А)-полимеразой, из которых первая отщепляет "хвост*' транскрипта, а вторая присоелиняет к 3'-концу зрелой мРНК около 200 адециловых остатков. Полиадениловая цепочка стабилизирует мРНК и способствует инициации трансляции, в связи с чем ее предложено рассматривагь как трапсляционный эпхансер (Мцпгос, 3асобзоп, 1990).
Спяайсинг. Матричную роль РНК выполняют только в цитоплазме. Перед перемещением из ядра в цитоплазму предшественники мРНК укорачиваются и превращаются в мРНК. Размер типичного гена и ядерной РНК млекопитающих составляет 15 — 17 т п.н.„а размер мРНК вЂ” около 2 т.п.н. Разница в длинах ядерной и цитоплазматической м РНК является следствием сплайсинга — процесса удаления интронов из цре-м РНК и формирования непрерывной белок-кодирующей последовательности нуклео- Глава!. Гели ЗЗ .гидов.
Сохранение правильной последовательности кодонов при сплайсинге достигается благодаря наличию на 5 '- и 3 '-концах и и- тронов специфических послеловательностей нуклеотидов. Эти последовательности высококонсервативны для белок-кодируклцих ядерных генов любого происхождения, причем у всех интронов на 5'-концах находится динуклеотид ОЬ, а на 3'-концах — динуклеотид АО (рис.
Е9). — -'пб слсПСАс Ап ~'— --- ' 5' ---,Эхзлв1)йС-..--САСПСАС вЂ” АСГЭхзлв2'- . 3' 1 --~~ ° в~ -------~~ 'ь'Л ":|в САСГ)ОАС АП вЂ”вЂ” — С ' САСПОАС АП Рис. Е9. Механизм сплайсипга ядерных генов животных; а — консервативные последовательности интро а; б — реакция трансэтерификвции: с помощью сплайсосо- мы 2'ОН ~руппа адепилового остатка сайта ветвления- атакует 5'-фосфоэфирцую связь иитроиа; е — образова- ние лареата и вторая реакция трапсэтерификации; г — объединение экзопов и освобождение лареата Сплайсинг зависит и от видоспецифических последовательностей цуклеотидов — сайтов ветвления, располагающихся в интронах на расстоянии 20 — 40 п.н. от 3'-концов.
В генах человека„ мьппи, крысы и других млекопитающих они представлены последовательностями СТОАС, дрозофилы — СТААТ, дрожжей— ТАСТААС. Эти последовательности обусловливают выбор динуклеотида АО на 3'-копне интрона. Если динуклеатид АО делегировать, то сплайсинг происходит по следующему такому же динуклестиду. Сплайсинг осуществляется сплайсосомой, состоящей из нескольких малых ядерных РНК (ятКИА), некоторые из которых и образуют каталитический центр, и неопределенного количества белковых факторов снлайсинга.
Сплайсосома содействует сближению сайта ветвления с 5'-концом интрона и их ковалентному 34 Часть 1. Генная инженерия ен ига соединению с образованием петли типа лассо, которая затем отсоелиняется от экзона на 3 '-конце, в результате чего экзоны смыкаются. Отметим, что механизм сплайсинга в митохондриях и хлоропластах иной: здесь сама пре-мРНК обладает аутокаталитической активностью. Сплайсинг — один из ярких примеров ~ енной инженерии, осуществляемой природой. В некоторых генах, имеющих несколько интронов, возможен альтернативный сплайсипг, что приводит к синтезу белковых изоформ — различных пептидов, закодировацпых одним геном (см.
обзор Апг)геаг)(в ег а!., 1987). Выбор способа сплайсинга определяется белковыми факторами, причем альтернативными могут быть 5'- или 3'-концы интрона. К примеру, ген кальцитонина крысы, содержащий два некодирующих и четыре кодирующих экзона, а также пять интронов (рис. 1.! 0), по-разному экспрессируется в различных тканях. В щитовидной железе он обеспечивает синтез гормона кальцитонина, регулирующего содержание в организме кальция, а в мозговых клетках обусловливает образование нейропептида СОВР (са!сгбошп депе ге!агег! ргогеш). Способность гена кальцитонина к дифференцированной экспрессии определяется альтернативным сплайсингом. Ьлагодаря ему из пре-мРНК образуются два мРНК, имеющих общие 5'- и разные 3'-концы. Эти мРНК обеспечивают синтез двух пептидов, из которых в результате процессцнга формируются активные гормоны — кальцитонин и нейропептид СОКР.
К редким случаям сплайсинга отпосигся межмолекулярный, или транс-с~п|айсинг. Он обнаружен у некоторых видов трипаносом и нематод, а также у человека. Например, многие мРНК трипаносом имеют одинаковую 5 '-лидерцую последовательность, состоягдую из 35 нуклеотидных остатков.
Эта последовательность не кодируется индивидуальными генами, а присоединяется к их мРНК путем сплайсинга со специальным типом РНК, которые являются донорами 5'-экзонов (рис. 1.1!). Соединение белок-копирующих сегментов из прерывных генов может происходить пе только путем сплайсинга. Известны случаи, когда сборка кодирующей части гена осуществляется на Глава 1. Гены 35 уровне ДНК.
Это один из механизмов необратимой дифференцировки клеток. Так, например, формируются гены иммунной системы у позвоночных, в частности гены иммуноглобулинов. Задача обеспечения синтеза десятков миллионов разнообразных антител в природе решается путем образования генов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов из комбинаций нескольких тысяч определенных генных сегментов. В этот процесс равный вклад вносят внутримолекулярные сайт-специфические рекомбинации между генными сегментами на уровне ДНК и сплайсинг.
П с! 12 с2 В сз рА! !4 с4 !5 рА2 Ген Транскрипция З' Пр- РНК Сил айсннг Щитов с! с2 сз с! с2 с4 3' 5' 3™ нк Трансляция с! ! сг 1сз С!! С2 !С4 Полипептипы Про цессннт СЗ С4 Я Я Гормоны Кальцвтонии Нейропептил Сокр Рис. 1.10. Альтернативный сплайсинг при экспрессии гена клльцитонина крысы. с — кодирующий экзон;! — интрои; а — инициирующий кодов; 4 — термииируюший кодов; рА — терминатор транскрипции и найт полиаленилироиания 36 Часть 1.
Генная интнеггерия и огра кодиругоотаа часть рй ~ — ":о Левый и»трон Правый ннтрои оц з' р — Ьйй- — — н з, пр рнк | Снвайсииг Лндсриа» *гасть Кодвруыыа» часть р з ырнк Рис. 1.! 1. Схема транс-сплайсипга (его механизм неизвестен). 1 — интроц; й — инициирующий кодаи; 4 — терминнрующий колон; рА .— терминатор транскрипции и сййт полиаленилирования Явление сплайсинга существует и у белков (см.
обзор Ве)(огт ег а)., 1995). В процессе белкового сплайси ига из полипептидных цепочек удаляются нефункциональные олигопептидные вставки (ийпеины). Трансйяг1ил. мРНК эукариот по своей природе моноцистронна, поэтому для посадки на нее рибосом и инициации транс5иции выработался иной механизм, чем у прокариот. У типичной мРНК 5'- лидерная нетранслируемая часть занилйает около 100 нуклеотидных остатков (н.о.).
Далее следуют кодирующая и 3'-нетранслируемая части, размер послелней — около ! 000 н.о. Активную роль в инициации трансляции и5 рвет 7-метилгуанозин. Он распознается белком СВР (сар Ыпйпй ргоге(п) „способствующим связыванию нескольких факторов инициации трансляции е1Р, которые в свою очередь способствуют посадке малой субъелиницы рибосомы на мРНК и ее пролвижению к стартовому кодону.
Из нескольких А(1(З-колонов, встречающихся на пути лвижения рибосомы, только тот является стартовым, который входит в состав сайта сборки рибосом: у вьюших эукариот — СС(А,Ю)ССА()ОС», а у низших — (А/Ру)А(А/())АА()ОЬСИ (С)яап, 1)опа)5це, 1987). Как правило, в подобные сайты вхолит первый А()О-кодов с 5'-конца мРНК. Здесь большая субъединица воссоединяется с малой и начинается сам акт трансляции (рис.
1.12). Глава !. Гены 37 ° —.— квв 7 то ,' тзвв 'у ав ° 7 х ~Щ!В 7 шо ! 40Э У 7 юпо ава ° ' 40ВУ юв кз 7 тО йвй Рис. 1.12. Схема инициации трансляции эукариотической мРНК. СВР— белок, связывающийся с 7-метилгуанозином (7тС); е!Š— факюры инициации трансляции; > — инициирующий кодоп; ВВБ — сайт связывания рибосом; 408 и 605 — малая и большая субъединицы рибосом ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 1.1. Если пермеаза лактозного оперона, предназначенная д.и транспорта лактозы внутрь клетки, индуцируется только в присутствии лактозы, то как она появляется в клетке? 1.2. Почему промоторы оперонов катаболизма сахаров относительно слабы? 1.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
