Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Позитивный кап«резь Гел лззллзалззуа Репуез ируе.евм геи уулдунлруеезлз Неактивный 1 Лепнину« Ин~инравтп Незкппиый звныесар Репрпснровзз1 Репресснровзи Инхтппровзи Рнс. 1.3. Схемы негативного (А) и позитивного (Б) контроля экспрессии генов В случае совместного выполнения несколькими белками опрелеленной Функции кодирующие их гены составляют группу с координированной экспрессиеи.
Если входящие в такую группу молекул репрессора. В случае неактивного состояния репрессора РНК-полимераза эффективно связывается с промотором. Активный репрессор своей посадкой на оператор мешает этому связыванию, выключая тем самым экспрессию гена. В случае позитивной РЕГУЛЯЦИИ РЕГУЛЯтОРНаа ПОСЛЕЛОВатЕЛЬНОСтьп С КОтОРОй СВУВЫВаЕтСЯ активатор, примыкает к промотору.
Посадка РНК-полимеразы на промотор возможна только после ее контакта на ДНК с активатором. Нюансированию регуляции способствует наличие у некоторых генов одного-двух дополнительных промоторов, один из которых обеспечивает некоторый базальный уровень экспрессии|сна, а транскрипция с другого (других) начинается при появлении в клетке определенных сигналов, Так, например, устроены гены, кодирующие ннлупибельную систему репарации ДНК. 22 Часть 1. 1енная ннзеенерия нн а!зо гены располагаются рядом, то группу называют опероном, если в разных местах — регулоном. Координация экспрессии генов в оперонах или регулонах достигается одновременным включением или выключением транскрипции этих генов. + — о — и — -Ф и — — — Р < БАК -80 -70 -60 -50 !О -30 -20 -зо 1 зо 20 30 р !ае! ! ', Р,о ° !аек !аеу ЫХ ! Ю =.аг ~':Ф.::.---.=.аГ...:.аЗ=знт =М" 'В' '::-=: тЗФ::1П 3' мрглг Белок р-Галаатозидаза Пермеаза траиеацетилаза Рис.
1.4. Лактозный оперон и этапы его экспрессии. р — промотор; о — оператор; ! — терминатор транскрипции; ВВБ — сайтсвязыванзи рибосом; БАК вЂ” саит для связывания комплекса сАМР— БАК; е — инициирующий колон; 4 — терминирующий колон Со строением оперонов и принципом регуляции экспрессии входящих в них генов можно ознакомиться на примере лактозного оперона (рис.
1.4). Этот оперон состоит из трех генов — 1асХ, 1асУ и (асА, продукты которых — р-галактозидаза, Д-газзактозидпермеаза и р-галактозиатрансацетилаза, соответственно, — необходимы для использования лакзозы в качестве источника углерода. Оперон имеет один промотор и перекрывающийся с ним оператор, а также один основной терминатор транскрипции, поэтому все входящие в него гены транскрибируются в одну поли- генную молекулу мРНК. На ней одновременно синтезируются все три белка, так как каждый входящий в нее ген обладает собственным сайтом связывания рибосом. Одновременно при необходимости прекращается и экспрессия всех генов оперона, что осуще- Глава 1.
Гены 23 ствляется путем посадки молекул репрессора на оператор. Ген 1ас1 репрессора лактозного оперона, расположенный рядом, экспрессируется конститутивно, так что в отсутствие лактозы оперон не функционирует (негативная регуляция). Замена сахаров в среде на лактозу приводит к лерепрессии (индукции) оперона, так как она обладает способностью связываться с репрессором и инактивировать его.
Таким образом, лактоза являегся индуктором 1ас-оперона. Лактозный оперон является объектом и позитивной регуляции, осуществляемой с помощью другого сайта, который находится рядом с промотором и одинаков для всех оперонов, подвергающихся катаболитной репрессии. Это явление заключается в следующем. Если в среле присутствуют олновременно глюкоза и какие-нибуль другие сахара, то бактерии используют только глюкозу. Индикатором отсутствия в клетке глюкозы является высокая кон цеггграция циклического АМР (сАМ Р) „обладающего способностью связываться с белком-активатором катаболизма сахаров (БАК).
Комплекс же сАМР— БАК имеет высокое сродство с сайтом позитивной регуляции оперонов, предназначенных для катаболизма сахаров (БАК-сайт). РНК-полимераза связывается с относительно слабыми промоторами этих оперонов только во взаимодействии с указанным комплексом, поэтому их транскрипция происходит только в отсутствие глюкозы (табл. 1.3). Таблица 1.3 Влияние на экспрессию ляктозного оперона состояний его еяйтов при катабодитной репрессии (+) — есть, ( †) — нет; з — занят; с — свободен.
Сходный принцип регуляции экспрессии осуществляется и в регулонах, только здесь каждый ген обладает собственным промотором и оператором. В некоторых регулонах часть генов объединена в опероны. Иапример, аргипиновый регулон состоит из 24 Часть 1. Генная инженерия ич иео 6 отдельных генов и 2 оиеронов. В начале каждого из них находится консервативная последовательность из 1о п.н., которая и служит оператором. Регуляция зкспрессии оперонов, обеспечивающих синтез каких-либо низкомолекулярных веществ 1наприлтер, аминокис.ют), обычно осуществляется конечными продуктами, которые выступают в данном случае как корепрессоры.
По достижении определенной концентрации эти продукты объединяются с молекулами репрессоров, способствуя тем самым их связыванию с операторами и блокированию транскрипции оперонов. Некоторые опероны, опрелеляющие синтез аминокислот, дополнителы ю регулируются с помощью так называемых атте нюаторов. — Лидериая часть - — й.
.4- . Аттеилоатор — й. т 2 э 4 р,о - 1л ~- —.. «<~- — ттря йй В=- — =-=Я ...: —.. —:. —. —. —.М вЂ” -----:. — =-е.=-1 51~4 — р Лидериая л1Р! 1К Лидеримй пептид г ~! э Ц 1,' ' Г ~„' .,' Незамтипееиыйиидериыйпептид 5' Рис. 1.5. Механизм аттенюации триптофанового оперопа. р — промотор; о — оператор; е — инициирующий кодов; 4 — термю ~ирующий кодон; ° — триптофановый кодон; 1, 2, 3, 4 — участки, принимающие участие в образовании шпилек Рассмотрим принцип их действия на примере триптофапового оперона.
Апенюатор располагается в лидерной части оперона, т. е. между промотором и первым геном. Он представляет собой нуклеотидную послеловательность с двумя гомологичными инвертированными повторами, так что шпильки могут образовываться участками ! и 2, 2 и 3, 3 и 4, причем шпилька 3:4 является терминатором транскрипции (рис. 1.5), а ее образованию препят- Глава!. Гены 25 ствует шпилька 2:3.
Лидерная гюследовательность транскрибируется в лидерпу|о РН К, содержащую ин4зормацизо о лидерном пептиде. В участке 1 находятся подряд два триптофановых кодона, а между участками 1 и 2 расположен терминирующий кодон. Поэтому от наличия или отсутствия в среде триптофана зависит степень завершенности синтеза ливерного пептида, что в свою очередь отражается на вторичной структуре лидерной РНК.
В присутствии триптофана завершение синтеза ливерного пептида сопровождается передвижением рибосом в участок 2. Это способствует образованию шпильки 3:4, благодаря чему атзенюатор приобретает свойства терминатора транскрипции и триптофановая мРНК не образуется. В противном случае рибосомы "застревают" в участке ! и по кинетическим причинам шпилька 2:3 образуется предпочтительнее, чем 3:4. Поэтому РНК-полимераза продвигается за атгенюатор и образуетполноразмерный транскрипт оперона. Регуляция на уровне трансляции встречается реже, чем на уровне транскрипции.
В этом случае заметную роль играют трансляционпые репрессоры. Одним из примеров являются антисмысловые РН К (асРНК). Случаи их использования в качестве регуляторов экспрессии генов и репликации геномов булут рассмотрены в гл. 2 — 4. асРНК транскрибируется, как правило, с начальной части регулируемого гена (не более 200 п.н.), но с другой нити. Она не является матрицей лля синтеза белка. Ее роль -- образовать дуплекс на 5'-конце мРНК и тем самым предотвратить ее трансляцию.
Другой пример — посадка некоторых белков при их избыточной концентрации на участки мРНК, содержащие инициаторы трансляции. Так, ДНК-полимераза фага Т4 связывается с ЯЭ-последовательностью собственного гена, белок оболочки фага К17 связывается с сайтом связывания рибосом гена репликазы того же фага и т. д. Молекулу ДНК нельзя рассматривать только как пассивное хранилище генетической информации, которая записана в линейной форме и реализация которой находится под контролем регуляторных белков и сайтов.
В последние годы было показано, что изгибы в структуре ДНК, присущие самой молекуле или вызванные посадкой на нее белков, играют активную роль в регуляции клеточных процессов (см. обзор Регех-Маг!!и ег а!., !994). 2б е!асть 1. Ренния инженерия га иГто В частности, изгибание промоторов при посадке на них РН К-полимеразы является дополнительным уровнем регуляции эффективности тра ~скрипции, чувствительным к физиологическому состоянию клетки. Таким образом, опероны и многие гены функционируют и регулируются независимо друг от друга.
Поэтому, меняя их локализацию в геноме или перенося в другие клетки, можно добиваться их экспрессии. Иногда же гены нельзя физически разделить, так как последовательности нуклеотидов, из которых они состоят, частично или полностью перекрываются, что особенно часто встречается в геномах небольших размеров (ДНК мелких бактериофагов, транспозонах и т. п.). Это позволяет экономигы енетический материал.
Классическим примером служит бактериофаг ФХ174. Его однонитевая ДНК, состоящая из 5386 нуклеотидов, должна бы кодировать белки, суммарная молекулярная масса которых составляет около 200 килодальтон (кДа), но фактическая молекулярная масса его белков — почти 240 кДа. Наиболее показательной в плане рационального использования ДНК является область около гена А этого фага (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
