Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Простейшими и впервые описанными 13оп1ап е! а1, 1968) транспозиционными модулями являются 18-элементы, состоящие из менее чем 2 т.п.н. Некоторые 1Я-элементни ТпЗ Тп1, 2 Тп4 Тп21 Тп 501 Тп551 Тп951 Тп!000 Тп1721 Тп5041 4,957 5,0 23,5 19,6 8,2 5.2 16,6 5,8 1 1,4 13,0 ТнЗ-нодоби А!» Ар Ар, Яш, 8ц Яш, Яц Е»п нты 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 38 38 38 35/38 35/38 35 4! 36/37 35/38 47 44 Часть 1.
Геняая инжеяеряя 1и иго были обнаружены как самостоятельные единицы (1Я! — 155), другие же, например 1310, !В50 и 13903, были найдены в составе транспозонов Тп10, Тп5 и Тп903, соответственно. Левый и правый инвертированные концевые повторы 1Я-элементов в большинстве случаев не идентичны друг другу.
В центральной части ! Я-элементов находятся 1 — 2 открытые рамки считывания, кодирующие транспозазу. Таким образом, 1Я-элементы содержат только гены и сайты, способствующие их транспозиции, и поэтому не придают клеткам какой-либо легко распознаваемый фенотип. Конечно, Ю-элементы, как и другие транспозоны, могут интегрироваться внутри генов, выполняющих определенные функции. Тогда об их присутствии можно судить по нарушению этих функций, а сам способ мутагецеза называют инсерционным.
Факт внедрения (инсерции) указывают знаком двойного двоеточия. Например, 1асХ::184 обозначает разрыв гена !5-галактозидазы элементом 154. !Я-элементы являются естественными компонентами бактериальных хромосом и плазмид. В разных цпаммах Е. со!1 насчитывается от 4 до 19 копий 151-элемента, от О до 12 копий Б2-элемента, около 10 копий 183-элемента, 1 — 2 копии 134-элемента и т. д. Их частоты транспозиции варьируют в пределах от 10-4 до 10-' на элемент на генерацию, а частота внедрения в определенный ген составляет в среднем 10 ' на генерацию. "Излечивание" от 15-элемента с воссгановлепием целостности гена не зависит от генов «есА и транспозазы и происходит с частотой на три порядка меньшей. Тл-элементы.
Эти транспозоны более слож~ пя по строению. В их составе свыше 2 т.п.н. Опи придают клеткам устойчивость к различным антибиотикам и солям тяжелых металлов, содержат информацию о синтезе энтеротоксина, гемолизина„о сбраживанни лактозы и в принципе могут нести любые друэне гены. По особенностям строения среди них можно выделиты руины составных трансцозонов, транспозонов Тп3- и Тп7-семейств и копъюгативных транспозонов. Составные транс позоны ограничены Б-элементами, находящимися в прямой (например, 1Б! у транспозона Тп9) или инвертированной (напрнмер, 1310 у транспозона Тп(0) ориентации (рис. 2.3).
Именно в них содержится информация о транспозиции данных трацспозонов. Концевые !В-элементы могут быть Глана 2. Трапспозоны 45 идентичны друг другу (например, 15903) или отличаться несколькими нуклеотидами, что обычно вызывает дефектность одного из них. Так, у Тп5 и Тп10 только правые повторы (1Я50К и 1ЯОК) функциональны, а левые выполняют лишь структурную роль. Не- дефектные концевые 1В-элементы способны к самостоятельному перемещению.
1В10К (и, естественно, Тп10) не образуют стабильных коинтегратов и переносятся нерепликативным механизмом. Вне зависимости от ориентации концевых 1Я-элементов составные транспозоны ограничены инвертированными повторами, поскольку концевые повторы самих элементов инвертированы. Центральная часть составных транспозонов несет гены, придающие клеткам устойчивость к антибиотикам и другие свойства.
гзгвь пи оп Рис. 2.3. Принципиальное строение составного транс позона Тп! О. (> — прямые повторы ДНК-мишени; 'г ч — концевые инвертированные повторы 15-элемента; тонкие стрелки — ориентация 1В-элементов; гег' — ген устойчивости к тетрациклнну Трап си озоны Тп3-семейства встречаются в г(хгмотрицательных и грамположительных бактериях, но, очевидно, имеют общее происхождение. Все они ограничены высоко гомологичными инвертированными концевыми повторами, состоящими из 35 — 48 пщ., и образуют повторы реципиентной ДНК из 5 п.п.
Центральные области этих трапспозонов, содержащие информацию об их транспозиции, в разной степени гомологичны друг другу. В большинстве из них локализованы также гены, придающие клеткам устойчивость к антибиотикам и (или) солям ртути. Только ген Нй и содержит, например, трансгюзон Тп5041, найденный в клетках Рхеипотопаа (Кйо1ос10 ег а!., 1997). Некоторые из транспозанов являются криптическими, т, е, не сообщают клеткам дополнительный фенотипический признак. К ним, в частности, относится транспозон Тп1000, содержащийся в Г-плазмиде. К ТпЗ-семейству 46 Часть 1. Генная инженерия ин Мни следует отнести и дефектный по транспозиции элемент 1Я 01, присутствующий в плазмнде рВС101, так как для перемещения он использует транспозазы и резольвазы этого семейства. Транспозон ТпЗ вЂ” первый описанный Тп-элемент, кодирующий устойчивость к антибиотику (Нес!яез, Засоб, 1974). В его центральной части располагаются гены Ыа (атр'), глрА и гпрК, а также сайт гез (рис.
2.4). Первый кодирует 0-лактамазу и обеспечивает устойчивость клеток к ампициллипу, второй отвечает за репликативную транспозицию, кодируя трапспозазу, а третий содержит информапию о резольвазе. Через сайты гез резольваза ведет сайтспециФическую рекомбинацию между транспозонами, "разрезая'* образовавшийся в процессе транспозиции коинтеграт. Наличие рсзольваз характерно только длл транспозонов этого семейства. Рис. 2.4. Генетическая карта транспозона ТпЗ.
'й — прямые повторы ДНК-мицзенн; 'г 4 — концевые инвертированные повторы трапспозопа; стрелки над генами указывакп направление их транскрипции Транспозоны ТпЗ-семейства обладают транспозицнонным иммунитетом. Это значит, что если в клетке имеется несколько репликонов, содержащих одинаковые транспозоны, то частоты межмолекулярных переносов снижаются на несколько порядков. В то же время внугримолекулярный перенос транспозона или перенос в свободный от транспозона репликон происходит нормально.
У транспозона ТпЗ транспозиционный иммунитет определяется одним из концевых повторов, причем в любой его ориентации и даже в изолированном состоянии. Транспозоны с почти идентичными концевыми повторами (Тп501, Тп!721 и др.) "иммунны" друг к другу. ПринадлежностьтранспозоновкТп7-семейству покаопределяется сходством функционального мотива их транспозаз. Кроме транспозонов, перечисленных в табл. 2.2, такой же мотив имеют транспозазы фага Мц и 1ЯЗ-элементов„а также интегразы ретро- вирусов (Кц(!соя!су ег а!., 1992; Кат!зггопт ег а!., 1994), поэтому можно Глава 2.
Транонозоны 47 говорить о Тп7-суперсемействе. Несмотря па сходство транспозаз, механизмы транспозиции его членов различны. Например, транспозоцы Тп402 и Тп5053 следуют репликативному пути через образование и разрешение коинтетратов (К1ю1ог10 ег' а1., 1995), а ретровирусы и транспозон Тп7 переносятся нерепликативным путем. Описанные транспозиции касались перемещения подвижных генетических элементов внугри одной клетки.
Однако у 5й"ергососсиз уаеса11з был найден транспозон Тп916, который с частотой около 10 ' передавался из клетки в клетку конъюгативным путем, оставляя в донорной клетке свою копию (Егапке, С!етчеП, 1981). Затем были описаны идругие конъюгативные транспозоны, среди которых есть простые и композитные (см, обзор Всоц, 199! ). Длина конъюгативных транспозонов достигает!00 т.п.п., так как наряду с генами трансцозиции они содержат па-оперон, т. е. информацию о способе конъюгации (см.
гл. 3). Все они обладают широким спектром хозяев и способны к транснозиции в грамположительных и грамотрицательных клетках. В этих же клетках они зкспрессируют и имеющуюся в них детерминанту устойчивости к тетрациклину, и другие маркеры устойчивости к антибиотикам. Механизм транспозиции транспозона Тп916 уникален, он похож на механизм вьццепления и интеграции профага ) (см. гл. 4). Интегрированный транспозон находится под негативным контролем собственного репрессора. При случайной дерепрессии транспозон вырезается из донорного сайта в кольцевой форме и в зависимости от состояния гга-оперона либо внелряется в случайные участки клеточной или плазмидной ДНК внутри клетки, либо передается в реципиентные клетки.
Его интеграция не сопровождается дупликацией ДНК-мишени. Как и профаг 7 трапспозон Тп916 подвержен зиготной индукции (см. гл. 4). Фиг Ми. Умеренный фаг Мо ( сочнее, его ДНК) и Мо-подобные фаги являются наиболее сложными бактериальными транспозонами. Они найдены пока только в клетках Е. со!1 и Рзеиг(отолах аеглятлоза, а дефектный вариант обнаружен у Яг|~еПа оузел1ег(ае. Кроме генов, ответственных за интеграцию и транспозицию, в ДНК этих фагов имеются гены, определяющие их вегетативное развитие и созревание. Таким образом, как транспозоны они необычны тем, что имеют внеклеточную форму существования. В 4о Часть Е Генная инженерия !и и!во Полинин ганы Охобласть В!и Рагьнис мны с Л и 1о! Ванн лама Мини Мн18А Рис. 2.5.
Схема строения генома фага Мв и некоторых мини-Мо. Штриховкой отмечена отсутствующая часть генол!а Сиецит1личность интеграции. Бактериальные транспозоны различаются по степени специфичности интеграции. Высокая степень свойственна элементам 132, 134, Б5 и! 550й. Например, консенсус сайта интеграции элемента 155 представлен последовательностью СТАО. Транспозон Тп10 характеризуется средней степенью специфичности (консенсус ОСТХАОС). этом они сходны с одним из типов эукариотических транспозонов — ретро вирусам и. Из транспозонов данного класса лучше всего описан фаг Мн (рис.
2.5). На концах его ДНК, состоящей из 37 т.п.н., расположены несовершенные повторы, которые распознаются транспозазой, кодируемой геном А. После инфекции клеток фатом Мц этот фермент в процессе консервативной транспозиции сближает концы линейной фаговой ДНК и обеспечивает через них ее интеграцию в случайные участки бактериальной хромосомы, одновременно образуя повторы из 5 п.н. реципиентной ДНК.
После этого возможны два пути развития фага — лизогенный или литический. Если генрепрессор с подавляет транскрипцию гена транспозазы, то интегрировшаяся Мо ДНК изасгрсвастн в виде профага в разных точках клеточной ДНК, поэтому в индивидуальных клонах локализация профага не изменяется. Репликативная транспозиция ДНК фага Ми происходит при его литическом развитии. Перенос все увеличивающегося числа копий Мц ДНК в разные участки бактериалы!ого генома постепенно приводит к его фрагментации, причем копии фаговой ДНК обнаруживаются в большинстве фрагментов. В этом процессе, кроме транспозазы, участвует продукт гена 1г. Глава 2. 2ралолозолы 49 '1 ранспозонвя же Тп2, Тп4, Тп5 и ДНК фага Мп интегрируются вообще в случайных местах генома Е.
со1Ъ Часглогпа гвралспозиааи. У бактериальных транспозонов она также варьирует в широких пределах !от 10 'до 10 '). При прочих равных условиях она зависит от длины транспозона. Установлено, что частота транспозици и составных элементов, фланкированных прямо ориентированными 1Я-элементами, уменьшается в два раза при каждом увеличении длины транспозона на 1 т.п.н. в1исло калий. Эгст параметр у зранспозонов существенно зависит от генотипа клеток. Например, 1Я- и Тп-элементы распределяются в клетках различных видов бактерий далеко не равномерно. Так, на каждую клетку Е со!1 К-12 приходится от 4 до 19 копий 1В1-элементов, на клетку Е. со!1 С вЂ” по 3, Е соб  — по 14 — 19, .%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
