Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 10
Текст из файла (страница 10)
г1уаелгепое и %. Яехлеп' — более чем по 40 копий. В клетках же 5. ОРЬиаилие„СйгоЪасгег1геишй, Егвчп!а ату!ов ого, Ргогеиз юигаЪйз, Рзеиг1отовах аегорлоза, ВааИпз аяЪЪ1Ь их вообще нет. ЗУКАРИОТИЧЕСКИЕ ТРАНСПОЗОИЫ Во всех известных случаях эукариотические транспозоны выявлены во фракциях умеренно повторяющейся ДНК. Как правило, они составляют семейства элементов, обладающих сходными нуклеотидными последовательностями. Каждый из таких элементов представлен несколькими десятками копий, которые занимают различные положения в геномах клеток разных линий. Анализ природы подвижных генетических элементов эукариот позволил обобщить представления о способах их транспозиции.
Стало ясным, что некоторые из них перемешаются в виде ДНК как бактериальные транспозоны, а другие — в виде РНК как ретровирусы. В соответствии с этим эукариотичсскис транспозоны подразделяют на две больших группы — классические транспозоны и ретротранспозоны. Классические траиспозопы Транспозоны этой группьп как и бактериальные, имеют на своих концах короткие инвертированные повторы, а при интеграции образуют около себя неболыпие прямые повторы реципиентной ДНК. 50 Часть К Генная инженерия и тнио Лучше всего охарактеризованы контролирующие элементы кукурузы, на существование которых указали опыты Б. Мак-Клинток еще в 50-х годах, и Р-элементы црозофилы.
В обоих случаях элементы обладают нерепликативным способом транспозиции. Контролирующие элементы кукурузы. Свое название эти элементы получили благодаря тому влиянию, которое они оказывают на экспрессию соседних с ними генов. Они вызывают целеции, дупликации„инверсии и транслокации ближайших к ним участков ДНК, но все эти генетические перестройки входят в программу развития растения. В геноме кукурузы содержится несколько семейств контролирующих элементов, которые делятся на автономные и неавтономные элементы.
Первые обладают собственными транспозазами и способны к самостоятельным перемещениям, а вторые перемещаются только в присутствии автономных элементов, относящихся к тому же семейству. Кажлое семейство представлено одним определенным типом автономного элемента и десятком неавтономных элементов, имеющих разную длину. Например, автономный элемент Ас (аспна~ог) насчитывает 4563 п.н. и содержит только ген трансцозазы, состоящий из пяти экзонов. Неавтономные элементы его семейства имеют длину от 4,5 до 2 т.п.н. Все элементы этого семейства обладают концевгями инвертированными повторами из 11 п.н. и окружены прямыми повторами реципиентной ДНК из 8 п.н.
Таким образом, неавтономные элементы являются целеционными вариантами автономных элементов. Р-элемеюиы. Эти элементы были обнаружены блшодаря их способности вызывать ибридный дисгенез у 0тозор!луа те!ало8азгег 1В)п8)запз ег а1., 1982; ВцЬ)п ег а1., 1982), что проявляется в асимметричных результатах скрещиваний мушек двух разных штаммов, Р и М. Скрещивание Р-самцов с М-самками обусловливает появление стерильного потомства, а скрещивание М-самцов с Р- самками дает плоцовитое потомство.
Как выяснилось, геном мушек штамма Р содержит до 50 копий Р-элементов, находящихся под контролем собственного репрессора, а в штамме М таких элементов нет. При слиянии Р-гамет с М-яйпеклетками Р-элементы дерепрессируются, и их транспозиция приводит к всевозможным перестройкам в ДНК зароцьплевых клеток. Размер Р-элемента— Глава 2. Траяоаозовы 5! 2,9 т.п.н. Его инвертированные концевые повторы состоят из 3! п.н., а прямые повторы реципиентной ДНК из 8 п.н.
Геном Р-элемента содержит четыре открытые рамки считывания (ОКР), разделенные интронами. Единственный транскриит генома подвергается тканеспецифическому сплайсишу: в транспозонной мРНК соматических клеток три первые ОКР объединяются и кодируют белок-репрессор, а в зародышевой ткани мРН К содержит все четыре ОКР и кодирует транспозазу (рис. 2.6).
Члены Р-семейства образуются благодаря делециям, происходящим внутри Р-элемента, и способны перемещаться только в присугствии Р-элемента с помощью его транспозазы. заосхыассаыс 0,,~~,,'',0,'э0 пб( (с:,,''',йс,', „' тааысосзаса аасос~ , Злрсааасыааа ыаих к — —., 1!.1 а фовго .'~', оаш ~'','овьэ '„' овгз ', ф.'.: гч )1 р Ссыапсысасы (! ГГТК70 К Рылы сто Рис. 2.6. Строение Р-элемента и его экспрессия в заролышевых и соматических клетках лрозофилы. ~> — прямые повторы ДНК-мишени; ь < — концевые инвертированные повторы Р-элемента; с — интрон; ОКŠ— открьпая рамка считывания Траиспозоны Л3-семейппва.
Транспозоны этого семейства обнаружены у 2). гле!опо8ахгек При общей длине 500 — 5000 п.н. они имеют инвертированные концевые повторы длиной 250 — ) 250 п.н. Концы определенного транспозона неидентичны, но даже у разных транспозонов они обладают обширными областями гомологии. Г(ентральные же части РВ-транспозонов совершенно негомологисгны друг другу. Они имеют разную длину, а иногда вообще отсутствуют (в таких случаях транспозон представляет собой типичную 52 Часть 1.
Гении» инженери» ьл иго палиндромную сгруктуру). РВ- транспозоны способны перемещать фрагментгя ДНК длиной до нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов, фланкируя их с обеих сторон. При перемещениях они образуют повторы реципиентной ДНК, содержащие по 9 п.н. Ретротранспозоиы Ретротранспозоны представляют собой группу транспозонов, механизм перемещения которых во многом совпадает с жизненным циклом ретровирусов. Этот механизм включает в себя процесс копирования (транскрипции) транспозонов, обратное копирование образовавшейся РНК вдуплексыДНК и внедрение последних вслучайные участки клеточного генома. Обратное копирование происходит с помощью обратных трацскриптаз, обнаруженных сначала у ретровирусов (Тепвп, М!хцгап1, 1970; Ва111пюг, 1970), а зател~ даже у Е соl! (1лп, Мааз, 1989). По этому признаку группа регрстранспозонов вквочает в себя сами ретровирусы, ретропозоны и ретрогены.
Реглуовирусы. Они содержат однонитевую РНК длиной б — 9 тысяч нуклеотидов, на концах которой расположены прял~ые повторы В и примыкающие к ним уникальные последовательности: ()5 на 5'-конце и ()3 на 3'-конце (рис. 2.7,а). Между ними находятся три локуса — яа8, ро1 и епл, кодирующие полибелки Оа8, Оай — Ро! и Еп». В капсиде находятся две молекулы РНК„интеграза, обратная транскриптаза и клеточная тРНК (разная у разных вирусов). Молекулы тРНК служат праймерами в реакции обратной транскрипции для синтеза первой (-)-нити ДЕ! К, связываясь для этого с вирусной РНК в сайте Р, расположенном в области ()5-8а8. Для праймирования синтеза (+)-нити ДНК важен полипуриновый тракт Ри, находящийся в области енг-() 3.
Сложная цепь полимеразных реакпий завершается формированием линейной двуцигевой ДНК (рис. 2.7,б), которая путем консервативной транспозиции с помощью интегразы внедряется в клеточную хромосому, образуя провирус. При этом, как и в случае фага Мв, генетические карты вирусной РНК и провируса оказываются одинаковыми (рис. 2.7,в). Всего в клеточном геноме поваляется около десяти провирусов, через транскрипты которых и происходит размножение вирусов. Провирусы ограничены длинными (250 — 1400 п.н.) концевыми поиорами ()3 —  — (35, называемыми 1 ТВ (1ощ гегпвпа! гереагз), кото- Глава 2. Тровевозовы 53 рые образуются в процессе обратной транскрипции за счет объединения и дупликации концевых участков вирусной РНК. На концах ! ТК, а следовательно, и провируса находятся короткие инвертированные повторы.
Наличие прямых повторов ДНК-мишени (4-6 п.н.) дополнительно подчеркивает сходспю провирусов с транспозонами. КЦ5 Рааа ~а по! 3 епт Рп РЗК Обратная транеарнпнна <тык-» а иоан„да,ят Ж ~'а т-опс Пз К г) Рис. 2.7. Принципиальная схема строения генома ретровируса и его провируса: о — вирусная РНК; б — вирусная ДНК; о — провирус; г — РНК дефектного ретровируеа, несущего онкоген (выделен жирной линией). !» — прямые повторы ДНК-мишени!» а — концевые инвертированные повторы провируса 1ЛК контролиру1от транскрипцию провирусной ДНК, так как в них находятся промотор (в 03), сайт полиаденилирования (в (.)5) и энхансер. Провирус транскрибируется в единую мРНК с промотора, находящегося в левом ЕТК, обеспечивая синтез полибелков ахай и Сая — Рой Интересно заметить, что синтез полибелка Епу происходит на субгеномной мРНК, которая образуется путем сплайсинга части вирусной РНК по сайтам Х Далее полибелки процессируются, превращаясь в десяток индивидуальных белков, в том числе структурных полипептидов и ферментов.
В частности, интеграза, обратная транскриптаза и протеаза, которая ведет процессинг полибелков, кодируются областью рос Транскрипты»щентичны исходной вирусной РНК, поэтому они являются не только 54 Часть 1. Генная иняеенерня ьн етее матрицами для синтеза вирусных белков, но и могут упаковываться в вирусные капсиды, инициатором чего служит сайт ря (Ч') расположенный рядом с О5. Инфекция клеток ретровирусами хотя и не вызывает их гибель, но и не безразлична для них.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
