Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 13
Текст из файла (страница 13)
2.5), но сохраня~отея, по крайней мере, концы ДНК и ген А (например, Ми18А). Без фага-помошника мини-Ми фаги могут интегрироваться в бисгериальную хромосому, образовывать делеции и вызывать слияние реиликонов. Если же у мини-Ми фага сохраняются и другие ранние функции, как, например, у МиЛ26, он, кроме того, способен осуществлять перенос бактериальных фрагментов. Мини-Ми фаг Ми40, утративший все сушесзвенные гены, переносит гены только в присутствии фага-помощника. Крут возможностей мини-Ми фагов существенно расширился после введения в них различных репликаторов, маркеров антибиотикоустойчивости и генов-репортеров (Сто(зшап, Сазаг!аЬап, 1986).
Это позволило не только извлекать гены из хромосомы и переносить их, но также проводить их анализ и мультипликацию (клонированиее). Мини-Ми фаги отличаются целым рядом преимушеств перед другими транспозонами в плане осуществления геномных перестроек и клонирования ДНК ьл Иго: ! ) у них высока частота трансиозиции; 2) нет специфичности к сайтам интеграции; 3) достаточно широк круг хозяев; 4) ими можно управлять с помощью термочувствительного реирессора (продукт гена с); 5) мини-Ми ДНК упаковывается ш иго в фаговые головки, иозтому ее можно переносить в другие клетки путем их инфекции. Фаги Ми и мини-Ми могут трансдуцировать бактериальные ~ены благодаря тому, что на ко1щах их ДНК (в основном на ираном конце, где локализуется геи 5) имеются вариабельные по длине и нуклеотидным последовательностям участки бактериальной ДНК.
На о-концах зги участки достигают ! — 2 т.п.н. Их размер определяется разностью между емкостью фаговой головки (38 тл1 н.) и длиной Ми ДНК (37 т.и.и.). Здесь может располагаться целый бактериальный ген, который фаг Ми способен переносить и который с частотой 1О ' — 10 ' может встроиться в бактериальную хромосому за счет КесА-зависимой рекомбинации. Фаг мини-Ми осуществляет ту же трансдукцию с частотой надва порядка выше, так как из-за небольшого размера его ДНК (несколько тысяч иар нуклеотидов) длина участка бактериальной ДНК на 5-концах может достигать 30 т.п.н.
64 Часть 1. Генная ннэхенер>м щ Иго При ренликации ДНК мини-Ми фигов некоторые фрагменты бактериальной ДНК размером до 25 — 30 т.ц.н. могут оказаться между двумя мини-Ми ДНК, наход>пцимися в одной ориентации. Такие структуры ведут себя как транснозоны. После упаковки в фповые головки и последующей инъекции в клетки они способны интегрироваться в случайные места клеточной хромосол>ы.
Этот способ КесА-независимой транслукции получил название миним>адукции. Мини-мюдукцию используют, например, для переноса и интеграции методами лч Иго чужеродных генов, когда КесА-зависимая рекомбинации неприменима. Частота мини-мюдукции низка (около 10 '), поэтому используют мини-Ми фаги с селективным маркером. Например, в мини-Ми >)лзг Ми!ВА был введен ген Ыа, позволяю> ций отбирать мини-мюдуктанты по их устойчивости к ампициллину. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 2.1. Почему при репликации Ми ДНК происходит фрагментация бактериального генома? 2.2. Гснетичсскис карты фага и профага Ми одинаковы. Почему? 2.3.
Слева или справа от любо~о конъ>огативного транспозона находится участок ДНК длиной несколько пар нуклеотилов, который он "прихватил" с собой из предыдущего сайта интеграции. Предложите модель транспозиции коныогативных транспозонов. 2.4. Между двумя одинаковыми транспозонами можст происходить гомологичсская рекомбинацня. К какому эффекту это приводит при локализации этих трапспозонов: а) на олнои хромосоме? 6) на разных хромосол>ах? ?.5.
В области расположения транспозона могуг возникать делецпи или инверсии. Чем это может быть вызвано? 2.6. Перечислите типы гсномных перестроек, вызывасмых бактериальными транспоэонами. 2.7. Составьте план зкспсримснта по мутированпк> плаэмианой ДНК, ссли транспозон-муга>сн находится в составе: а) бактериальной хромосомы; б) другой плазмилы. 2.8. Почему мини-мюлукция является >лесЛ-псзависил>ой? 2.9. "Излечиванис" от транспозонов с восстановлснисм целостности гена не зависит ог гснов >есА и транспозазы.
Презщожптс модели этого механизма. 2.10. Предложите возможный махани>м образования дсфсктного рстровируса (см. рнс. 2 ?,г), несу>цсго онкогсн. Глава 3 ~ЛАЗМИДБ1 в) С вЂ” —— Клетки, приобретающие плазм иды, как правило, приобретают и новые признаки. Зти признаки легли в основу названий обнаруженных впервые плазмид, а именно: Г-плазмид (фактор пола), придающих клеткам донорные свойства; Со1-плазмид, способствующих синтезу колицинов; и К-плазмид, определяющих устойчивость (резистентность) клеток к антибиотикам.
Многие свойства плазмид зависят от содержащихся в их составе транспозонов. Плазмиды определяют как стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы. Они являются обычным компонентом бактериальных клеток, но встречаются также и у низших эукариот. В большинстве случаев плазмиды представляют собой суперскрученные ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК длиной от 2 до бОО т.п.н Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз. Существуют также линейные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонуклеаз обеспечивается тем, что концы нитей их ДНК защищены белками (Н)гос)11Ка, Яайайцсп(, !982) или соединяются ковалентно (Сварчевский, Рыбчин, 1984; рис.
3.1). з' ( 5 в) ~)~ ;,/ Рис. ЗЛ. Типы плвзмии: а — кольцевая; б — линейная с белком иа 5'-конце; в — линейная с концевыми шпильками, замыкающими ковалентно обе нити ДНК 66 Часть Ц денная инженерия ~н иян Общие свойства бактериальных плазмид Реллнкаинл. Основным свойством плазмид является способность к автономной репликации. Молекулы ДНК приобретают ее в том случае, если в них имеется сайт начала репликации — оп' и, как правило, набор генов, необходимых для ее осуществления.
Такие молекулы получили название репликонов. Хромосомы прокариотическим клеток содержат по одному опьсайту, поэтому они относятся к монорепликонным системалк Плазмидные ДНК могут иметь по несколько опьсаитов. Репликоны функционируют лишь тогда, когда в клетках есть все необходимые для этого ферменты. Клеточные хромосомы включают полный набор генов, кодирующих белки репликационного комплекса.
Внехрочосомные же генетические элементы содержат не все необходимые для этого гены, поэтому в их репликации принимают участие и клеточные ферменты. В большинстве случаев кольцевые плазмиды гралютрицательных бактерий ренлицируются однонаправленно в тета-форл1е (закрытое кольцо; рис.
3.2), а грал1положительных — в сигма-форме (катящееся кольцо; см. с. 94). оп МФ оп' .. эв:=.А б) РНК-пояанораи,гов ~~,,'~ Ппаи,п;ЕоПП 'с оп ап ав - энж'- :~-- ь' Рис. 3.2. Схема однонаправленной репликации кольцевых плазмид а тета-форме: а — строгий контроль; б — осяабленный контроль Различают плазмиды со строгим и ослабленным контролем репликации.
Минимальный размер плазл1ид со строгим контролем репликации 20 — 30 т.п.н., а максимальный — на порядок больше. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невелики по размеру — не более 15 — 30 т.п.н. Глава 3. Плазчидм 67 Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у цих механизма ограничения числа копий до ! — 3 молекул на клетку. При этом репликация кольцевых плазмид осуществляется, как правило, клеточными репликативными комплексами (реплисомами).
В клетках Е. сой хромосомный оп-сайт (опС) содержит четыре 9-чле нных г/лаА-бокса (консенсус ТТАТ(С/А) СА(С/А)), с которыми связывается белок ВпаА. Он "плавит'* структуру ДНК в оа-сайте и при содействии белка ВпаС способствует посадке на этот сайт геликазы ВпаВ. Образовавшийся комплекс распознается праймазой ВпаО и ДНК-полимеразой П1, состоящей из кор-фермента ВпаЕ и других субъединиц (КогпЬегд, ВаКег, 1992) „что инициирует движение репликационных вилок в обоих направлениях. Плазмиды Е. со!! со строгим контролем рецликации использучот все вышеперечисленные белки, включая ипициаторный белок ВпаА, шн которого в их ог1-сайгак имеются г)лаА-боксы.
Но основную роль в инициации репликации играют собственные инициаторные белки (Кер-белки), узнающие в плазмидных ол-сайтах специфические множественные прямые повторы (итероны). Плазмиды Г. со!! с ослабленным контролем репликации для инициации репликации используют РН К-пол имеразу и Д11К-цолимеразу 1.
Элонгацию ведет ДНК-полимераза 1П. В каждой бактериальной клетке содержится в среднем 40 — 50 плазмилных копий, такие плазмиды называют еше мульт икопийными. Разница между строгим и ослабленным контролем репликации плазмид особенно заметна„когда клетки переходят из экспоненциальной фазы роста в стационарную. При этом плазмиды со строгим контролем и бактериальная хромосома перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бактериальной ДНК. Аналогичная картина наблюдается и в условиях остановки синтеза белков, например при добавлении в среду хлорамфеникола.
Каждый раунд репликации бактериальной ДНК и плазмид со строгим контролем требует синтеза инициирующих белков, поэтому синтез этих ДНК останавливается. Плазмиды же с ослабленным контролем в таких условиях способны инициировать новые раунды репликации, поэтому их число может достигать нескольких тысяч на клетку. б8 Часть К Генная инженерия гн егю Репликация плазмид обоих классов осуществляется в основном бактериальными белками. Поскольку эти белки в клетках разных видов бактерий отличаются друг от друга, то плазмилы поддерживаются только в ограниченном числе близкородственных видов клеток. Известны, однако, примеры плазмид, имеющих широкий круг клеток-хозяев. Такие плазмиды обладают гибкой системой белков, необходимых для их поддержания в различных семействах бактерий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
