Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 17
Текст из файла (страница 17)
И в данном случае РНК П процессируется в опьсайте, а образовавшийся транскрипт длиной 555 п.н. служит праймером лля инициации репликации ДНК- полимеразой 1 по лидирующей нити. Синтез ДНК по комплемептарной нити начинается со сборки праймосомы на сайте раз (рптозогпе аззегпйу яге), расположенном на расстоянии ! 50 нуклеотидов от опт'-сайта. Еше далее (400 нуклеотидов от ог)у'-сайта) в другом сайте раз на лидируюшей нити происходит смена ДНК-полимеразы ! на ДНК-полимеразу П !. Сформировавшаяся таким образом репликационная вилка осуществляет один раунд репликации. Р аиу гм Рнк! Рис. 3.! 2.
Генетическая карта плазмиды Со1Е1. Стрелки над генами — направление их транскрипции; стрелка у опн' — направление репликации ДНК, горизонтальные стрелки— направление транскриптов РНК1 и РНКН; р — лролютор. Коор- динаты даны в т.п.н. Негативный контроль числа копий осуществляют два плазмилных фактора. Это, прежде всего, транскрипт РНК ! (103 п.н.), образукпцийся со второго промотора и камплементарный 5 '-концу транскрипта РНК П.
Дуплекс РНК ! — РНК П стерически Глава 3. Плазлшды 87 препятствует образованию дуплекса ДНК вЂ” РН К П в области опЧ- сайта, блокируя тем самым инициацию нового раунда репликации. Количество плазмидных копий регулируется также геном гор (КМА огйап!х!п8 рго!е!и), продукт которого повышает скорость образования дуплекса РНК 1 — РНК П. Транскрипт РНК 1 может блокировать репликацию ряда родственных мультикопийных плазмид, обусловливая их несовместимость с плазмидой Со! Е1. Отметим здесь, что механизм несовместимости плазмид, осущесгнляемый с помощью антисмысловых РН К„ очень гибок. В принципе достаточно изменения у входящей плазмиды одного нуклеотида в области образования дуплекса РНК 1— РНК П, чтобы воспрепятствовать его образованию и сделать, таким образом, плазмиды совместимыми.
Возможная нестабильность, вызываемая мульгимеризацией, у плазмиды Со1Е1 предотвращается присутствием в ее геноме локуса сег, продукт которого "разрезает" мультимеры в специфических сайтах. Плазмида Со!Е1 может быть мобилизована любой конъюгативной плазмидой, что свидетельствует о независимости процессов мобилизации и конъюгации. Процесс мобилизации состоит из нескольких этапов: введение ника в сайте огЛ (прежнее назнание Ьогл) плазмидной ДНК, "пилотирование" 5'-конца разорванной нити к предобразованному конъюгационному мостику, перенос нити в реципиент, восстановление целостности плазмиды в донорной клетке и,возможно, инициация синтеза комплементарной нити н рсципиентной клетке.
У Со! Е! за этот процесс отвечают четыре белка, кодируемые перекрывающимися генами в области тоЬ (Воус! ег а!., 1989). Плазмиды с широким кругом хозяев Рассмотрим свойства конъюгативной плазмиды КК2 и неконъюгативной КЯР1010 — представителей групп несовместимости 1псР1 и 1пс! 1, соответственно. Каков механизм, который позволяет им стабильно поддерживаться почти во всех грамотрицательных бактериях, а плазмиде КК2, кроме того, еще и конъюгировать с грамположительными клетками и дрожжами 88 Часть 1. Генная инженерия и1 ткоо (Не1пегпапп, Брга8це, 1989)? Полного ответа на зтот вопрос пока нет, но ясна обгцая идея зтого механизма.
Арк опт оп"т' Рис. 3.13. Строение плазмид с широким кругом хозяев: а — плазмида КК2'„б — плазмида Р5Е10! О. Стрелки у опт' и опТ вЂ” направление репликации и перено- са ДНК, соответственно. Координаты даны в т.п.н. Глава 3. Олазииды 89 Плазмида ЛК2. Эта плазмила размером 60 т.п.н., (рис. 3.13,а) и близкоролственные плазмилы КР1 и КР4 имеют относительно невысокую копийность — 5 — 8 молекул на бактериальную хромосому. Механизм строгого контроля числа копий у них более сложен„чем у плазмид Е и К1. Минимально лостаточный репликон состоит из опт-сайта и гена ПуА, кодирующего в одной рамке лва инициаторных белка, которые связываются с итеронами в опт-сайте. Для инициации репликации, илушей в одном направлении, нужен также белок РпаА, мишень которого — ИпаА-бокс— нахолится тоже в олУ-сайте.
Вспомогательную роль играют опероны й1 и йм; которые предположительно обеспечивают неизвестным пока способом нечувствительность плазмилы к смене хозяев. Известно лишь, что пролукты генов /согА и 1согВ подавляют транскрипцию гена ггГА, но этому препятствует продукт гена Е1Л3. Элонгацию репликации ведут бактериальные белки. Такая гибкая схема снижает зависимость числа копий плазмилы от концентрации белка Тг(А. В ней заложены возможности лля инициации репликации в разных семействах клеток. Малый Тг(А белок используется в Е.
со11, а большой — в Р. аеги81поза. Инсерционная мутация между итеронами и г(паА-боксом подавляет репликацию в Е со11, но не в Р. аеги81поза. Делеция двух итеронов в тссайте увеличивает число копий в А8годасгепит гитегасгепгь но не в Е. со11. Небольшая лелеция участка, прилегаюшего к огЮ-сайту и нужного лля посалки какого-то бактериального белка, блокирует репликацию в Е со11, но не в А. Гите1ас1епк В стабильность плазмилы различный вклад вносят гены локусов раг, И1, йв.
и лаже транспозон Тп1. Локус раг состоит из двух авторегулируемых противоположно направленных опсронов— рагСВА и раЮЕ. Белки РагВ и РагС, возможно, обеспечивают распрелеление ~шазмил по дочерним клеткам, а белок РагА является резольвазой, которая разрешает коинтеграты через сайт тт (шп1йпег гево1ппоп в)ге), находящийся в промоторе гена рагС. Белки оперона раЮЕ функционально и структурно сходны с белками Ссс1 плазмилы Е. Токсичным является белок РагЕ„который„правда, не убивает клетки, а вызывает их филаментацию; белок РагР нейтрализует его лейсгвие.
И в этом случае сравнительная значимость оперонов зависит от клетки-хозяина. Делеция оперона рагСВА не влияет на стабильносзь плазмилы в Е. со11, А. гите~апет, А~овздасгег т1пе1апдл', 90 Часть 1. Генная инженерия са тио но существе«но дестабилизирует плазмиду в Р. аегие1лоеа и в АстегоЬасгег со1соасейсик Делеция локуса рагИЕ не существенна в А.
са!соасеггсиз, но сказывается в А. и1пе1апг(и. Конкретная роль оперонов И1 и /гогВ в стабилизации плазмиды до конца не выяснена. Два белка оперона йогА гомологичпы белкам РагА и РагВ плазмиды Р, сходны и сайты их действия. Это позволяет прелположить возможность их участия в распределении ДНК по дочерним клеткам. Резольваза ТпрК и сайт гез транспозона Тп! способствуют разрешению плазмидных коинтегратов. Конъюгативность плазмиды КК2 обеспечивается покусами ла! и Гга2. В первом солержатся оггТ-сайт и гены, инициируюшие перенос ДН К.
Второй локус обеспечивает Мр(-функцию, т. е. ответственен за установление физического ко!пакта между лонорной и реципиентной клеткой. Отметим, кстати, что с помошью этой плазмиды был достигнут существенный прогресс в по«имании механизма ретроконъюгации. Так названо явление переноса генов (плазмидных или хромосомальных) из реципиентных клеток в лонорные. В опытах на Е. сой (81а ег а1., 1996) донорные клетки содержали плазмиду КК2, а реципиентные клетки— плазмиду рЕКА28 (1пс() Моб"). За 24 часа контакта почти все реципиентные клетки приобрели плазмилу КК2, а у 0,4 % донорных клеток была обнаружена плазмида рЕКА28.
При замене плазмиды КК2 на ее вариант с дефектом в опТ, который блокирует акт переноса плазмилы, но не образование конъюгационного мостика, эффект полностью пропадал. Таким образом, во втором случае мобилизуемая плазмила рЕКА28 "не воспользовалась*' образовавшимся каналом переноса. Прелполагается, что перенесенная в первом случае плазмида рКК2 изменила пол реципиентных бактерий «а противоположный и побудила их образовать новый конъюгацио«ный мостик или переориентировать старый. Отмечено также позитивное влияние оа-оперона на стабильность плазмиды: популяция клеток с дефектным гга-опероном содержит заметно большую долю бесплазмидных бактерий (81а ел а1., 1995). Игазмида ЛЮИ010.
Эта плазмнла детерминирует устойчивость к стрептомицину и сульфо«амидам (рис. 3.13,0). Несмотря паевой относительно небольшой размер (8,68 т.п.н.) она кодирует, кроме инициаторного белка КерС, который связывается с огФ-сийгом, Глава 3. Плазмиды 91 праймазу КерВ и геликазу КерА. Из бактериальных белков ею используется только ДНК-полимераза Ш.
Плазмида КВГ1010 неконьюгативна, но эффективно мобилизуется коньюгативными плазмидами почти во все вилы клеток, включая грамположительные (Оопп!еу, Оаисз, 199!). Для этого у нее имеются три гена лоб (пюЬ!1!гаг!оп) и сайт начала переноса опТ. У плазмиды отсугствует раг-локус, так как она мультикопийна (15 — 40 копий). Тьчиазмиды Аягобастепит ~ите~ас(елз Агробактерии А. глгле~ас(елз вызывают появление корончатых галлов (опухолей) у двудольных растений (см.
гл. 5). Вирулентность этих бактерий зависит от содержащихся в них конъюгативных Т1-плазмид (Т1 — гппюг-1пбпс)пя) размером от 140 до 250 т.п.н. В процессе инфекции фрагмент этих плазмид размером около 25 т.п.н., называемый Т-ДНК, переносится в растительные клетки и ковалентно связывается с ядерной ДНК. Гены, располагающиеся на Т-ДНК, активно транскрибируются, вызывая не только неконтролируемый рост трансформированных растительных клеток, но и появление в них необычных аминокислот — октопина, нопалина и других опинов. Октопин состоит из аргинина и пировиноградной кислоты, а нопалин представляет собой соединение аргинина и а-кетоглутаровой кислоты. Эти аминокислоты могут использоваться бактериями А. !иглесиас(епз в качестве источника углерода, азота и энергии, если они содержат Т)-плазмиды, которые несут информацию об их катаболизме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
