Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Второй тип теломер сначала был обнаружен у вируса осповакцины, а первым примером прокариотической ДНК подобного строения явился ш|азмидный прог!ьзг !Ч15 (Сварчевский, Рыбчин, 1984). Этот объект открыл новый полраздел в классификации прокариотических плазмид, в котором значатся еше только плазмиды спирохет Воете(га ЬиерУог~егг, описанные позже (ВагЬоиг, Стагоп, 1987). Строение теломер этих плазмид представлено на рис. 3.1б.
Подобные гиазмиды найдены в митохондриях некоторых грибов и хлоропластах растений. Механизм их репликации неизвестен. Глава 3. Плазмиды 97 ° Ф вЂ” — - - — за и и - - — — — — — — — -~ ГГ! 5 Г; О 1тАтлАт ~ Ооас 1Гятт ,'ОтотостОАтяао сатятсяослслс) Алтс ~оссс !лттлтл ~с с с|АтАГГл ~ сссо ~стая сяслсолстятсс ОГАтАстсогото!ГГла~Гасо1тлхткГ (О О ,а АГАЛТ ~ТТТ' ЬЗТ ~ АОТЛГЛЗАОТы ВаМГЯТСТАСТ , 'сяас, АЛЛ! ЛТТЛГ Т Т ТАПА ~ аЛЯ Т ~ ааяя ! ТСЛТатсТСАГа спояаАсАТОА ГТТГа ~ ТПа ТААТЛ )А !Л Т вЂ” — - - 25 па. — — -- — — — — ..4 р16 ! — — - - Опас .- —.-- и Рис.
3 16. Строение тсломср линейных плазм ил 1ч 15 Е соя и р! 6 Гя ЬиГХАГОГУеят. Стрслкамв указаны концевые инвертированные повторы; прямоугольниками выделены одннаковыс последовательности; строчными буквами обозначсны различаюшисся в повторах нуклеотиды Гад. Гс! пвнЛы ппс ааапГВ Гсш сас ас Рис.
3.17. Генетическая карта линсиной плазмиды 1ч15 2-микронГГая плазмвда дршюкей У зукариот основную долю внехромосомной ДНК составляют ДНК оршнелл. Плазмиды описаны в основном у низших эукариот — дрожжей, простейших и грибов, а также у некоторых высших растений. Они могуг локализоваться в ядре или в митохондриях. Плазмида Х15, хозяином которой служат клетки Е.
Со(1, уникальна для бактерий кишечной группы. Ее стабильное поддерживание обеспечивается стандартными для низкокопийных плазмид локусами ге7Г и рог (рис. 3.!7). ЛГТГГейность плазмиды зависит от гена те1 теломеразы, формирующей теломеры Ге((. и те%. Регуляцию зкспрессии плазмидных генов осу! цествляют локусы ГттА и Гттрз, отвечающие за иммуннтст лизогенов (см. гл. 4), а также локус тс.
Он кодирует антисмысловую РНК, обеспечивая функцию несовместимости. Появление плазмиды в клетке сопровождается возникновением у них устойчивости к фату Т1, что определяется геном сог(лизогенная конверсия, см. гл. 4). 98 Часть 1. Генная инженерия 1н 1тио Лучше всего изучена 2-микронная плазмида дрожжей Х сегеия)ае (ее длина 2 мкм, отсюда и название).
Плазмида найдена во многих штаммах дрожжей. Она представляет собой кольцевую молекулу ДНК (6318 п.н.), локализуется в ядре клетки и составляет около 3 % всей дрожжевой ДНК (около 80 копий на гаплоидный геном). Молекула 2-микронной ДНК содержит два идентичных инвертированных повтора 1В1 и 1К2, включающих по 599 п.н.
(рис. 3.18). Между инвертированными повторами в сайте г цТ, сосгоящем из трех 13-членных повторов, (н иио происходит внугрнмолекулярная сайт-специфическая рекомбинация, детерминируемая геном ГАР. Благодаря рекомбинации 2-микронная ДНК сушествует в двух формах (А и В) в соотношении 1:1. РЬР КВР2 Форма Л Форма В Рис. 3.18.
Строение 2-микронной ДНК дрожжей (формы А и В). Тонкие стрелки — локализация и направление транскрипции генов; стрелки по диаметру — участки саят-специфической рекомбинации; стрелки в оп-свите — направление репликации В первом повторе находится ее ог)-сайт, с которого инициируется двунаправленная репликация.
Его присутствия достаточно д~и автономной репликации плазмил, так как структурно он сходен с хромосомными огйсайтами (АЯЯ, см. гл. 5) и репликация плазмиды полностью обеспечивается клеточными ферментами. Однако в таком случае число копий невелико. Повышению ко- 1лава 3. Пламя>ды 99 пий>юсти 2-микронной ДН К содействует Г1Р-рекомби нация, так как акт рекомбинации сразу после прохождении репликационной вилки через ближайший к ог>-сайту повтор меняет способ репликации с тета-формы на катящееся кольцо, преодолевая тем самым характерный лля эукариот запрет на повторную инициацию репликации с»г1-сайта на время, пока нс произошло деление клетки.
Клк>чевую роль в стабилыюсти плазмиды играют гены ВЕР1 и ВЕР2, продукты которых в виде гстеродимера связываются с 9- >ленными повторами. Эти повторы в разных количествах имеются в сайте ВТВ, в промоторных областях генов ВЕРЧ и РЕР, в щ>вп>рах !К! и!К2. Через сант ЯТВобеспечивается распределение плазмидных ДНК по дочерним клеткам. Связывание гетеродимера с лругими наномерами необхолимо для регулирования числа копий плазмиды. Оно происходит путем подавления транскрипции генов ВЕР1 и РЕР, а также путем физического препятствия Г) Р-рекомбинации через посадку на инвертированные повторы.
Сайт ВТВсо связанным на нем гетсродимером играет роль сайленссра по отношению к гену ВАР продукт ко»>рого в норме способствует экспрессии гена РЕР, и полавляст его транскрипцию. Баланс кинетик всех этих реакций приводит к поддержанию в клетке заданного числа копий плазмиды. Природная генная ннжеперня плазмнд Плазмиды в мире микроорганизмов играют роль своеобразных посредников (векторов) при мсжклсточном обмене генами. Многие из таких генов, в частности, гены устойчивости к аьп ибиотикам, попадают в плазмиды с помощью транспозонов и интегронов (см. >л.
2). Этот процесс способствует быстрой адаптации ю>сток к изменяющимся факзт>рам среды. Часп>та таких явлений в природе сравнительно невысока, Однако в последние десятилетия она возросла в результате чрезмерного использования в медицине антибактериальных препаратов и загрязнения окружающей среды промышленными отходами. В клиниках вместо ссгесгвенных чувствительных штаммов с>зли выделять их варианты„успзйчивыс к применяемым лекарственным веществам, а в местах скопления промышленных отхолов и ядов были выявлены микрос>рганизмы, нашедшие здесь для себя экологическую нишу. 100 Часть 1. Генная инженерия ьц нето Каньон ацнн (и Р4) опТ Обратопгнис комплекса Введениеника 'гг1г П2 тгггЕ2 | Связывание ДНК с аппаратолг экспорг в тпги Тга2 Бакгериалммн клетка Расппельнаи клетка Реципиент Рис.
3.19. Сравнение схем переноса генов в растительные и бактери- альиые клетки цгг- и Гка-системами (по 1.еаа1, 1.ап1га, 1994) Перенос Т-ДНК Правая граница Т-ДНК Укй! тгпП2 тгггПЗ 7ггП4 тгггв11 Ъ'~гВ4 | Ньпсснсннс нити н сс лашгпа ТгвЗ Тга1 ТгвН ТгвО ТгЬВ ТгЬЕ Глава 3. /7лазмиды 10! Способность плазмид переносить гены обеспечивается механизмом конъюгации.
По-видимому„он возник на ранних этапах эволюции бактерий, поэтому сходен у разных видов клеток по своему устройству, а гены и белки, участвующие в этом процессе, зачастую высоко гомологичны. У Воп!еге!!а реггизг!г этот механизм приспособлен даже для экспорта токсина (%е!за ег а!., ! 993).
Возможно, это является причиной универсальности Мр(-функции лпоперонов, способной устанавливать конъюгационный контакт между клетками, атносяшимися к отдаленным родам и семействам, и даже царствам. Например, переносу генов между клетками Е. со!! и дрожжей Х сегемм!ае способствуют не только плазмида КР4, имсющая широкий круг хозяев, но и Р-плазмида Более того, обе плазмиды содействуют мобилизации плазмиды Со!Е1 (Не!пегпапп, Ярга8пе, 1989). Вопрос только в том, каким образом перенесенные плазмиды можно сохранить в реципиенте. Эволюционное ролство механизмов конъюгации наиболее отчетливо видно при сравнении двух систем переноса генов — Гга у плазмиды ВР4 и ю.у Т(-плазмиды (рис.
3.19). Одинаковы нс только этапы переноса, но и гомологичны многие белки, участвующие в этом: У|гО2 и Тга1, У!гО4 и ТгаО и др. (см. обзор 1езз1, 1лпка, 1994). В лиТ-сайте и в концевых повторах Т-ДНК имеется также консервативная последователыюсть из 12 п.н, в районе, где вводится ник. Об эволюционной близости !лз- и г!г-механизмов свидетельствует и тот факт, что мсжклеточный канал, образованный г!гсистемой, может использовать плазмидная тоЬ-система.
В частности, глоб-система плазмиды КБР1010 успешно использована вместо Т-ДНК для переноса генов из бактерий А. гижегасгвлз в клетки табака (Вцспапап-Жо!!аз!оп ег а!., 1987). Еше более впечатляющим примером природной генной инженерии служит сам факт переноса генов Т!-плазмидами из бактерий в растительные клетки и экспрессии плазмидных генов в растениях, Отметим также роль плазмид в смене белков внешней мембраны клеток, что приводит к нх антигенной вариации и способствует повышению устойчивости бактерий против иммунной системы животных. Такую функцию у спирохст Вогге!ья выполняют их линейные плазмиды.
Оказалось, что различие в серотипах этих бактерий вызвано разницей в строении белков Утр, 102 Часть 1. Генная инзхенгрия 1л и во которые кодируются этими нлазмндами (см. обзор ВагЬоиг, 1990). Гены тглр в разных плазмидах либо транскрибируются, либо находятся в неактивном состоянии из-за отсутствия промотора. Нсяснылг пока рекомбинацнонным механизмом неактивный ген может заместить активно работающий, что и приводит к смене поверхностного белка. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1. Вошедшая в клетку несовместимая плазмида имеет меньше шансов вытеснить резидентную, чем быть самой вытесненной. Г!очему? 3.2. Белок йерБ плазмиды Р способен к авторегуляции собственного синтеза. Каким образом? 3.3.
Отмечено позитивное влияние на-оперона на стабилыюсть плазмпды. популяция клеток, у которых плазмида содержит лефектный Ла-опсроц, солсржит залгетно большую долю бесплазмндных бактерий. Как это можно обьяснить? Зхй Олины являются вндукторами на-оперона Т1-плазмид, способствуя тем самым переносу плазл1нд в бесплазмидные клеткьь Какой в этом биологический смысл? Знй Как осуществляется контроль числа копий у плазмил? Можно ли, не мугируя плазмиды, менять число их копии? 3.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
