Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Назовите основные механизмы, обеспечивающие стабильность плазмид. 3.7. Предложитс механизм реплнкации линейных плазмид, у которых обе нити на концах ДНК ковалснтно замкнуты. 3.8. В чем заюиочается роль РБР-рекомбинации у 2-микронной плазм иды дрожжей? 3.9. Что указывает на эволюционное родство механизма копыогацнн с механизмом переноса генов Т1-плазмидами в растения? 3.10. В чем заключается биологическая роль плазмид? Глава 4 Перенос клеточных генов с помощью вирусов широко распространен в природе.
Об этом уже упоминалось при описании фагатранспозона Мп и ретровирусов (см. гл. 2). Явление было впервые обнаружено у фагов (Уз)пг1ег, (.ес(ег(>егя, 1952) и получило название трансдукции. Различают общую (генерализованную) и специфическую трансдукции. При обшей трансдукции в своей головке фаг несет произвольный фрагмент бактериальной ДНК. После инфицирования клеток таким фатом вошедший фрагмент может встроиться в бактериальную ДНК и проявиться фенотипически. При специфической трансдукции фрагмент бактериальной ДНК связан ковалснтно с фаговой хромосомой и реплицируется в ее составе.
Это позволяет мультиплицировать трансдуцируемые бактериальные гены и манипулировать ими в лабораторных условиях. Явление специфической трансдукции было открыто при работе с умеренным бактериофагом Л, развивающимся в клетках Е. еай К- 12 (Могзе ег а1., 195б). Этот фаг является представителем большого семейства лямбдоилных фагов. Он сьпрал исключительную роль в развитии молекулярной генетики и генетической инженерии. Столь же значительна роль нитевидных фагов семейства М13. Их ДНК широко используется в качестве векторов.
Поэтому для понимания многих аспектов генно-инженерных работ необходимо знать основные элементы их генетики и биологии развития. По трем причинам более леталык> описан фаг Л. Во-первых, это классический объект, послуживший моделью при изучении регуляции экспрессии генов вообще и временного программирования развития фатов в частности.
Во-вторых, в 60-с годы он явился объектом, на котором была заложена база генетической инженерии — представление о векторе и возможности клонирования и экспрессии в нем чужеродных генов. В третьих, в 70-е годы 104 Часть 1. Генная иткенерин и тп генная инженерия гп иго, основанная на его использовании и предназначенная для анализа генома Е. со)й успешно конкурировала с методами !и уйгц ФАГ й. Генетика.
Описанию фага А посвящено две монографии (Фаг лямбда, 1975„1 агп(х!а П, 1933). Его двунитевая линейная ДНК состоит из 435!4 п.н. и содержит около 60 генов (рис. 4.1,а; табл. 4.1). На ее концах имеются однонитевые комнлсментарные участки, состоящие из 12 нуклеотидных остатков (сот-сайты). Они обеспечивают превращение линейной молекулы ДН К в кольцевую. Такие концы молекул получили название липких. $ь1 тна. р1.
ы I гм ра, аа неа пц '. Р Е Х Рис. 4.1. Генетическая карта фага й и канатика транскрипции его генов. а -- генетическая карта; б — предра~ние мРНК; е — ранние мРНК; г — поздняя мРНК, д — мРНК, синтезируемая профагом. Олно~ гаправлепные стрелки обозначают и РНК, двунаправлен- ные — функцию.
Расшифровка названий генов и сайтсв лана в табл. 4Л Глава 4. Фа:и !05 Табл и ц а 4.1 Роль основных генов и сайтов фага Х Функции белков или назначение саитов Гены и сайты А'и1, А, 1х', 8, С, 1УиЗ. д, Е, Л, Я1 Х,КК6,Т,О, м,е,к,7,.( Обласгь Ь (8 генов) глГ Образование головки ха ехо Бег лат А!7 сП.
с1П А' гехАВ с! гго Образование отростка Несущественна для вегетативного развития фага Интеграция и исключение ). ДНК из бактериальной хромосомы Исключение Х ДНК из бактериальной хромосомы Участие в гомологической рекомбинации (экзонуклеаза) Участие в гомологической рекомбинации Ингибирование бактериальной экзопуклеазы У Инакгнвапия клеток Позитивная регуляция генов с1 и (лг Позитивная регуляция ранних функций путем антитер- минации лево- и правосторонней транскрипции в сайтах Г!.1, гй!, 11(2 Исключение развития других фатов Репрессия всех фаговых функций через операто- ры ой и ой Частичное подавление транскрипции через операто- ры о1.
и оК Р!нициапия репликации Х ДНК Узнавание оьчзсайта и связь с белком ярР Инициация репликации Х ДНК. Связь с фаговым белком лрО и бактериальным белком ОпаВ Позитивная регуляция генов 5'- з путем антитерми- нации транскрипции в санте РК Регуляция лизиса клетки через взаимодействие с цитоплазматической мембраной 1! изис клеток (эндолизин трансгликозилазного дей- ствия) Лнзис клеток (эндолизин эндопептидазного действия) 1Об Часть 1.
Генная инженерия (н и во Окончание гнала. 4. 1 Ф кции белков или назначение сайтов Гены и сайты Сайлгм Интеграция Л ДНК в бактериальную хромосому Промотор транскрипции гена (лг, зависящей от белка СН Промоторы левосторонней (1.) и правосгоронней (К) транскрипции генов Промотор транскрипции гена е1 в лизогенном со- стоянии Г!ромотор транскрипции гена с1 при установлении лизогенного состояния (зависнт от белка СП) Промотор правосгоронней транскрипции генов Л' — Х Операторы, связывающие белки-репрессоры С1 и Сто Терминаторы лево- (1.) и правосторонней (К) транскрипции Терминатор транскрипции, инициированной с промотора р'К Связывание продукта гена 1У с РНК-полимеразой Регуляторная обласп, содержащая сайты нигК, гй! и рЕ Начало двусторонней репликации Л ДНК Однонитевые комплементарные концы линейной Л ДНК, необходимые для ее циркуляризацин аег р1 р1., рК р'К о1, оК й,1, гК1, гК2 ниг(., яигК У он Развитие фага Л осуществляется в три этапа и начинается с прсдран него периода, который охватываетвремяотпоявления его ДН К в цитоплазме до синтеза первых фаговых продуктов.
В предраннсм периоде развития принимают участие только бактериальныс ферменты: ДНК-лигаза (превращает линейную молекулу Л ДН К в кольцевую) и РН К-полимсраза (осуществляет считывание регуляторных генов )У и сга с промоторов р1 и рК). Образовавшиеся в этот период цепи мРНК обрываются в терминирующнх сайтах 11.1 и (К1 (рис. 4.(,б) благодаря действию клеточного фактора терминации Кпгх Ран н и й период развития фага начинается после синтеза в клетке )ч-белка, который связывается с РНК-полимеразой в сайтах лиг и писк (пн( — 1~ н(цйзагюп), помогая ей преодолевать терминаторы транскрипции.
В резуяьтаге транскрипция, ин иции- рованная в предранний период и прерванная в этих сайтах, продолжается, обеспечивая образование продуктов правого и левого ранних опсронов (рис. 4.!,в). Правый содержит репликационныс гены 0 и Р, а левый — рскомбинационные гены гв«(ехо и <>ег). Наиболес ошетсгвенпым моментом раннего периода яв><яется репликация фаговой ДНК.
Для сс инициации нужна транскрипция <>и<- сайта с пролк>гора р1 и наличие фаговых бслк<>в ЬрО и ярР (яр— лопе рго<)вс<). Продукт гена 0 бифункционалеш одной частью он "у<п<ает" оп'-сайт, располагающийся в самом гене, а другой — взаимодействует с Р-продукгом, который в свою очередь через белок ВпаВ связывается с репликационным комплексом. Анализ образовавшихся л»»яо ренликативных интермедиатов свидетельствует о том, что а) на супсрскручешюй молекуле ЛДНК с оп'-сайта может инициироваться и лвусторонняя, и односторонняя (25 % молекул) репликация и что б) уже с первых минут инфекции репликация идет и в тета-, и в сигма-форме.
Предполашется, что у лшлскул с односторонней направленное>ью репликации п<>еле ол<к>го рау> <да синтеза ДНК 3'-конец синтезированной нити вытесняет ее 5'-конец из интермелиата, что и является переходом на сигма-4х>рму репликации. В этом случае у кольцевой молекулы ДНК появляется линейное ответвление (кокатемср), состоящее из нескольких фаговых геномов, разделенных сш-сайтами.
Такая структура в поздний период обеспечивает упаковку ЛДН К в головку фага, так как для процесса упаковки обязательно наличие в ДНК как миниум двух с<>з-сай<тов. Развитию фага препятствует бактериальная КесВСО экзонуклсаза (экзонуклеаза Ъ), которая активно расщепляет линсйныс молекулы ДНК, начиная с их концов. Сохранносгь конкатемера обеспечивает продукт фагового гена ял>л, инактивируюший экзонуклеазу. В случае мугации в этом гене КесВСР экзонуклсаза расщепляет копкатемср, и упаковка Л ДНК происходит только с использованием кольцевых мультимеров, образующихся с помо>цью Ке<( и КесА функций. В клетках гесВСР- зависимость развития фага Л от рекомбинационных функций пропадает.
Из-за пониженной "урожайности" фаги Лге<('далг <рормирук>т лишь маленькие негативные колонии на газоне гесА' клеток. Нормальное развитие этих фатов воссганавливас<ся, если в их геном ввести сл<ссайт, который является "горячей"'точкой КссА-зависимой рекол<бинации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
