Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Обычно из штаммов Е вой К-12 вьшеляют, например, только дефектные 1-частицы, несущие яа1-оперон. Делегирование генов с1с1(Э-Ря1 позволяет изолировать жизнеспособный фаг Лр1,а1, у которого ясс1-оперон замещает область Ь. В!964 пщу Кюззн иЖакоб предложили метод переноса ~снов в разные участки бактериальной хромосомы с помощью плазмид. Они использовалидлязтой цели плазмиду Г; -1ас. Термочувствительность ее репликации являлась Глава 4. Фааи 1!3 селективным признаком лля отбора клеток с интегрированными плазмидами. Ьеквис и Сигнер в 1966 году применили этот метод для интеграции плазмиды Г',,-(ас по обе стороны от нрофага Ф80 (представитель семейства лямбдоидпых фагов) и из соотве ктвующих штаммов выделили трансдуцируклцие фаги ЯОд(ас типов Лла( и Лб(тх '1 ак впервые было осугцествлено включение в трансдуцируюший фаг гена, располагающег ося далеко от профага.
При наличии рядом с профагом гена, инактивапия которого приводит к появлению селективной о признака, возникает возможность прямого огбора клеток с нужной локализацией интегрированных плазмид. Исключительно удобным для этой цели оказался находягцийся рядом с профагом ф80 локус голВ, поскольку из-за его инактивации, вызванной интеграцией в него гпазмиды, югетки приобретают устойчивость к фагам Т1 и 680, а также к колицину В.
Инактивированный ~ ен яа(Е тоже является селективным маркером, позволяющим отбирать бактериальныс ппаммы, плазмиды у которых интегрировались рядом с сайтом гл(Л. После интеграции плазмиды Г; -(ас в «и(-оперон и приближения гена (пс к Л-профагу методом делеций бьш выделен широко известный фаг Лр(ас5, с помощью которого впервые мстолом (л нлоудалось изолировать ген (ас18!зарйо е( а1, 1969). Метод слияния плазм ид основывается насближении бактериалы юго пп-сайта с вьшеляемым геном пугем рекомбинации плазмнд, несущих эти локусы. Отбор рекомбинантных молекул базируется на свойпгве несовместимости родственных плазмид.
Напримср, после конъюгации клеток Е со(( К-12 гесАте(Ваг8()/ Рте(В аг8Е" и гесА(гр('Г'(гр'а((ф80 на среде без метионипа, аргинина и триптофана развиваются только клетки с рскомбинантной плазмидой Гуле(В'гв8Е лр"аа)80. Мутации гесА предотвращают рскомбиьшцию плазмид по областям гомологии. Поэтому плазмилы объединя~отса че(хв 1Б-элементы. Зго позволило сблизить сайт айг80 с генами те(В и а~8Е настолько, что после посадки профага Ф80 в данный сайт удалось вылелить фагн ~)80дте(В и ф80с)агяЕ'.
Чаше все~о новые варианты трансдуцируюших фагов получают с помощью необы чн ых посадок и рофага (метод Шимады). Для эффективной инте~рации профага Л нужна полная гомология участков О фагового и бактериального а((-сайтов. Профаг может интегрироваться с различной частотой и в лругие участки 114 Часть 1. Генная инженерия гн егрс бактериальной хромосомы, называемые вторичными агг-сайтами. Это легко обнаруживается при делетировании основного алВ-сайта.
Есп определенная корреляпия между степенью гомологии участков О вторичных авссайтов и эффективностью интеграции в них профага. Необычная интеграция профага внутри гена приводит к инактивации последнего. Однако и в этом случае можно вьщелить фаг, несущий неповрежденный ген. Например, из штамма, в котором профаг Л интегрирован в ген ггрС, выделены фаги ЛлрАВС' и Лйр'СЕ)Е. Их рекомбинацня между собой по агг-сайтам с помощью! п1-системы позволила восстановить целостность ггр-оперона и получить трансдуцирующий фаг ЛрарАВСОЕ 1рис.
4.4). нравс' нв ыд н с! л л у ь2 ь)гспе я) л ) лвс в1 главе) д б) л ) Ьл СПЕ Н Ы К л ) гч)лвспе чч я) л г) Рис. 4.4. Способ восстановления исходной структуры гена в трансдуцнрукзщих фагах, полученных методом Шнмады: а — генетическая карта профвга Л, нахолящспюя в гене Стриптофанового опсрона; б н е — карты трансдуцнрующнх фатов ЛргейАВС' н Лргг)гС1)Е; г — карта трансдупир)чоцгсго фага ЛргенАВСЕ) Е, полученного в результате рекомбинации фатов ЛрорАВС' н Лргер'С1)Е по гибридным сайтам агг Если в гепомах умеренного фага и бактерии имеются гомологичные последовательности нуклеотидов, возможна и н т е г р а ц и я профага через области гомологии с помо)цью КесА- зависимой рекомбинации и последующая трансдукция близких к профагу генов.
Этот способ получения трансдуцируюгцих фагов был впервые применен при лизогенизацни клеток фатом ф80г)гнегВ, причем профаг внедрился в ген н)егВ. Из данного штамма удалось выделить фаги ФЗОс)гроВ и ф80е)я)уТ, поскольку гены ероВ и я1уТ локализуются на бактериальной хромосоме рядом с геном те)В.
Глава 4. Фаггг 115 Этот метод особенно удобен при использовании транспозонов, локализованных на фаговой ДНК. Если нужно провести направленную интеграцию профага, то рядом с соответствующим бактериальным геном внедряют гомологичный транспозон. Так была осугцествлена посадка профага ХцЮ2 рядом с опероном Ка1 (рис. 4.5,а), лля чего была сконструирована пара фагов ХрМи', каждый из козорых несет один из концов Мц ДНК. ДНК этих фагов интегрируются в разные концы профага Мц, который встраивают вблизи нужного гена. При этом один из профагов ХрМа' оказывается рядом с данным геном и в случае и!щукции профага извлекает его из бактериальной хромосомы. Создана коллекция из более чем 200 штаммов Е.
со)1'с различными посадками транспозона Тп 10 и его производного Тп10)гав (Япяег ет а1., 1989). Благодаря селективным генам Тсв и Кглх и областям гомологии она позволяет маркировать и выделить большинство бактериальных локусов. Йг с) ° Ф— ч— Вс! 1З2 с1 Н РОР 1 АК Р О !З2 сын ра! ВОВ" ЬМ 6) Ф ас! Бг Ы Н Р'ОВ ра! сЫП 1З2 ОР К А 1 РОВ' Ыс Рис.
4 5. Схема ин геграции профага 221 В2 в бактериальную хромосому через 1В2-элемент (а) и инверсии участка ДНК в результате рекомбинации между агг-свйтами Р'ОР и ВОВ' (б) 1!6 Часть!. Генная инженерия !и еЬо Рассмотренные мстолы сближения !снов с профагами используются также для выделения транслуцируюших фагов, несущих гены других видов бактерий, перенесенных в клетки Е. са(Ь Например, перенос плазмилы г'Ь1з из клеток 5'. ОрЬ1тиг1ит в клетки Е.
са1!' и ес интеграция в покус гопВ позволили выделить фаг ф801)Ь(тн несу!ций гистидиновый опсрон клеток сальмонеллы. Другой пример. Клсгки Е. са1! нс могут использовать гистидин в качестве источника углерода, а клетки Х !урЬ!тиг(ип! могут, поскольку имеют опероны Ьид локализуюц!исса между генами еа1 и Ью. Оказалось, что в клетках Х ЬрЬ!!пинит в данной области располагается собственный сайт апЛ. Поэтому конъюгациоцный перенос области еа1-Ь!о из гц!сток Х 1урЬ!тиг1тпп в клетки Е.
соЬ и лизогснизация гибридных клеток фарам Л дали возможность выделить фаг ЛрЬиг. С помощью описанных методов выделено более 100 трансдуцируюших фагов Л и !)80, несу!цих различные бактсриальныс гены. Такие фа! и являются продупентами соответствующих продуктов, если трансдуцирусмый ген сохранил собственный промотор или стал членом фагового оперона.
Выход продуктов можно увеличивать, используя фаговыс мутации, которые отсрочивают время лизиса (Я), блокируют все (Ь1) или только поздние (О ) функции. Например, при развитии фага Л 1'„Г рггрЕ антранилатсинтстаза составляла более 25 % всего растворимого клеточного белка (Мои, Вгапнлаг, 1976). Перенос трапспазаное и плизмид. Трансдуцируюшис фаги после ввсления в них транспозонов приобретают способность интегрироваться в бактсриальную хромосому и тн9 переносить гены с помощью системы -ь -Ф 1Б! !3! транспозиции. В норме трансдуцируемый ген закрепляется в рсциписнтной Хстп9Ью клетке благодаря происходящей в ней КесА-зависимой рекомбинации или 1п1- зависимой интеграции профага. В то же время фаг ЛхТп9Ью осуществляет переЬю нос гена Ью в условиях дефектности генов гесА, !пг и ге!1.
Это вызвано тем, что кольпевая ДНК данного фага фактически представляет коинтсграт двух Рис. 4.6. Строение ДНК траисдуцируюшсго фага )с:То9Ыа Глава 4. Фага ! 17 генетических структур, разделенных 1Я-элементами (рис. 4.6). После инфицирования клеток фатом 7 хТп9Ь!О коинтеграт распадается в результате рекомбинации по! Я-элементам, причем каждая из двух образовавшихся структур может интегрироваться в бактериальную ДНК через свой 1Я-элемент. При отсутствии в бактериальной хромосоме гомоло! ичных элементов и в случае лелеции агг-сайта и гена ин профаги локализуются в случайных местах. Из бактериального штамма, в котором этот профаг внедрился в ген Й!сУ, удалось выделить транслуцирующий фаг Хр1асХ.
Способность транспозонов образовывать коинте!раты используется для трансдукции фагом Х небольших плазмид. В таких случаях для увеличения емкости фагового генома в область Ь вводят делеции. Например, коинтеграт из двух репликонов Х Ь519Ь5!5 и некон ьюгативной плазм иды рМ В9х1 пЗ упаковывается в фаговую головку. В реципиентных клетках, инфицированных полученным фаголизатом, коинтеграт распадается, в результате чего появляется свободная плазмида (рис. 4.7).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
