Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 26
Текст из файла (страница 26)
В области размером 22? тльп. около ог)-сайта 204 из 272 генов расположены также. Менее понятно, почему в этой же области такое же направление имеют 48 из 56 с!льсайтов, являющихся инициаторами ВесВС()-пути рекомбинации. В клетках Е. со!! К-12 имеется один активный профаг Л и четыре близких ему дефектных профага И Р12, гас, г!!и и е14. Их ориентация на хромосоме также не случайна. Все, кроме профщ а г)!и, расположены по часовой стрелке (СагпрЬей, 1992). В этом же направлении расположены другие лямбдоидные профаги — НК022, Р22, ф80, 21 и А11ав. Причина такого единообразия интересна, но непонятна. Анализ генома Е.
со!! с помощью методов конъюгации и общей трансдукции позволил расставить на ее генетической карте более 1000 генов (Вег)уп еГ а!., 1996; упрощенный вариант см. рис. 3.10). Карта разделена на 100 мин, по 47 т.п.н. в каждой единице. Картирование новых генов классическими методами по мере детализации карты становится все более трудоемким. С целью упрощения процедуры картирования сконструирована коллекция из !82 изогенных щтаммов, которые в различных сайтах содержат транспозон Тп10 или Тп10)сап, имеющий вместо тетрациклинового маркера канамициновый. В набор для их использования входит также 21 штамм Нуг, обладающий теми же маркерами. Картирование новых генов происходит в два этапа.
Сначала с помощью Нбэштаммов устанавливается локализация гена в пределах 5 — 15 мин карты. Далее для уточнения локализации гена в пределах 1 мин используется фаг Р1, позволяющий определить, между какой парой маркеров он находится (81пяег ег' а!., 1989). 134 г1асгь 1. Геггннп ингкеннрггя кн гон Зукариппг геские клетки Дифференциронка клеток у дрожгкей Х сегенгз(ае. Дрожжи являготся одноклеточными грибами. Они размножаются либо почкованием как Х сегег гзгае, либо лслен нем как .Ыггтвзасс(гаготусез рагггйе. Другую груггпу составляют многоклеточные мицеляльные грибы, образующие многоядсрные тубутгярные нити (фгиламсггтьь). К наиболее изученным относятся Агеигозрггга сгазза и Аз7ге уПиз гггйгг1аггк Клетки Х сегеггз(ае облалают всеми признаками эукариот.
В их геномс, состоящем из 16 хромосом, нет оперонов, транскриппиго ведут три типа РНК-полимераз, а мРНК имеют типично эукариотическое сгроение. Дрожжи солержат спегги4ггичсские эукариотические белки (гистоны, актин, тубулин, пептилные гормоны) и зукариотические органеллы (ядерную мембрану, митохондрии, 805 рибосомы, гяшоплазмвтические мембраны, аппарат Гольлжл, лизосомы). Каждая их хромосома несет по одной центромере, по лве теломсры и состоит из нескольких репликонов. Клетки Х сегег гзгае являются первым эукариотическим организмом, геном которого полностью секвеиирован (Сойер ег а(., 1996). Последовательность из 12068 т.п.н, включает в себя 5885 белоккодирующих генов, 140 генов рРНК, 275 генов трг!К и 40 генов малых ядерных РНК. Центромерами называют участки хромосом, которые в процессе митоза служат для удерживания вместе сестринских хроматил и для '"растаскивания"' образовавшихся хромосом к разным полюсам лелягцейся клетки.
Центромеры хромосом взаимозаменяемы. Дрожжевая пентромера(СЕ!ч) состоит из -120 п.н, и представляет собой АТ-богатый участок, фланкированный консервативными последовательностями: ТСАСАТОАТ-(>90% А+Т, 80 — 90 п.н.)-ТОАТТТССОЛА. Теломерами называгот концевые участки хромосом. У всех эукариот принцип их строения одинаков. Каждая теломера состоит из длинных серий коротких тандемных повторов.
Обобщенная формула этих повторов — С„(А/Т), где п>1, а гп=-1 — 4. У человека — С,ТА, у Х сегечзгае — С А(СА),, Средний размер дрожжевого репликона 40 т п.н. Локусы лрожжевых хромосом, ответственные за инициацию репликации (ана- 1"лава 5.
Клетки 135 логи оп'-сайтов), обозначают как АКВ (ащопогпопв1у гер1(саг(п8 вес)пепсе). Каждый из таких локусов сосгоит из -50 п.н. и включает в себя ключевую (соге) последовательность АТТТАТРоТТТА, несколько гомологичных ей на 80 % последовательностей и сайт для связывания одного из транскрипционных факторов. Этот фактор, по-видимому, входит в состав комплекса из -6 белков общей массой -250000 дальтон, который инициирует двустороннюю репликацию дрожжевой ДНК. В зависимости от внешних условий дрожжи следуют одному из двух путей развития — гаплоидному или диплоидному (рис. 5.1).
В условиях достаточного питания в течение 100 мин клетки проходят стандартные для эукариотических клеток фазы митотического цикла — О1, Я (синтез ДНК), С2 и М (митоз). В отличие от бактерий, клетки Х сегеияие не делятся пополам, а почкуются, т. е. дочерняя клетка вырастает из материнской, покрываясь вновь синтезируемой клеточной стенкой.
В неблагоприятных условиях 1аплоидпые клетки спариваются с партнером противоположного типа спаривания. Образовавшиеся диплоидные клетки после мейоза формируют гаплоидные споры, которые затем прорастают, и циклы повторяются. Таким образом, дрожжевые клетки обладают рядол~ свойств, которые характерны для мноюклеточных организмов, в частности, возможностью специализации клеток, способностью к межклеточному контакту и мейозу. У многоклеточных организмов разные типы специализированных клеток выполняют разные функции в организме. У лрожжей специализированные клетки играют различные роли в процессе их жизненного цикла. Есть три типа таких клеток: способные к спариванию гаплоидные клетки а и а, а также образующиеся после спаривания диплоидные клетки а/а, способные к мейозу и споруляции.
Клетки а и а обладают различными сигнальными системами, позволяющими им устанавливать контакт друг с другом и спариваться. Каждая из них производит свой внеклеточный пептид, а-фактор или а-фактор, узнающий специализированный рецептор только на клетке противоположною типа спаривания. Клетки а/а не производят зти факторы и не способны к спариванию. Разница между клетками определяется двумя аллелями локуса МА Т. о-Клетки обладают локусом МАТа, а-клетки — локусом МАТц а/а-клетки — обеими локусами. 136 Часть 1, Генная иттженерпл тл ига 9 й 01 6С) й С> (") О Гавлова ССа) Оа а-фаИбрвг Саари вкиис Диплоид ® и обратоваиив спор Спора Ь Распад т станки аска ф Прорастание спор ЯЯК я, Рис.
5.1. Жизненный цикл дрожжевых клеток .т. сегекйтпе: и —. митотический клеточный цикл, через который проходят гаплоидные и диплоидные клетки; указаны фазы развития. Материнская клетка обведена толстой линией, отпочковывающаяся дочерняя клетка — тонкой линией; ядро выделено штриховкой; а — переход диплоидных клеток к мейотическому делению, в процессе которого каждая клетка образует аск, содержащий четыре споры.
Споры прорастают н почкуются при переносе их в питательную среду Глава 5. Клеенки 137 Генетический аппарат дифференцировки клеток находится в третьей хромосоме. Здесь па расстоянии около 350 т.п.н. друг от друга находятся локусы НМла и НМ2хх, а между ними располагается сходный с ними по строению локус МАТ. Все три локуса состоят из двух одинаковых (Хи 2) и двух разных (1а и 1а) генных сегментов. Сегмент 1а кодирует полипептид а1, а сегмеггг 1а— полипептиды и! и а2. Эти сегменты не экспрессируются в локусах НМла и НМ2,а из-за действия находящихся в них сайленсеров. Переключение аллсльных состояний производится путем внугриклеточной транспозиции сегмента 1а или Уа в локус МАТ (рис.
5.2). После этого начинается синтез полипептидов а! (в а-клетках) или а! и а2 (в се-клетках), которые регулирутот экспрессию четырех групп генов. Полипептил а! служит позитивным регулятором транскрипции генов, обеспечивающих а-тип повеления клеток; полипептид а2 в тех же клетках служит негативным регулятором транскрипции генов, обеспечивающих а-тип повеления клеток; лимер а! — а2 в клетках а/а выключает синтез полипептида а! и блокирует транскрипцию большой группы 1енов, функционирующих только в гаплоидных клетках.
Один из генов этой группы, ТсМЕ1, кодирует ингибитор другой группы генов, отвечающих за споруляцию. Подавление его экспрессии в диплоидных клетках в случае голодания обеспечивает переход к спорообразованию. Выключено Включено Выключено НМ1. мАТ, имка 1 Т"*';Г ! Г от ч — — — Фу! Замена кассеты ! НО Т1канспоаициа ч нмь мАТ имка -ЫИъйЮ вЂ” Т . ] —.> а1 МФ вЂ” — 150 тп.н.
— — М Рис. 5.2. Строение области трегьей хромосомы Х сегеивлае, управляющей сменой типов спарывания. В покусах МА Т стрелками указано направление считывания генов; сегмент Уи выявлен штриховкой 138 Часть 1. Генная иняеенерня 1н лен Перемещение У-ссгментов в локус МА Т вызывается действием сайт-специфической эндонуклеазы НО, ген которой находится в другой хромосоме и экспрессируется только в гаплоидных материнских клетках и только в стадии О). Сегменты Х и У служат сай1вми рекомбинации при трансг1озиции.
Копии сегментов Упосле их переноса в локус МА Тосгаюгся и в исходных локусах, а заменяемый в локусе МА Тсегмепт У, естественно, теряется. Клетки с геном НО гомоталличны, т. е. в них почти каждое клеточное деление сопровождается сменой сегмента Ув локусе МАТ. Поэтому подобные гаплоидные клетки дают потомство, обладаю1дее любым типом спаривания Клетки с поврежденным геном НО (аллель йн) гетероталличны. В этих клетках в локусе МАТзафиксирован определенный сегмент т', поэтому для них характерен только определенный тип спаривания, и зиготы в их популяции не образуются.
Интересно отметить, что полная дифференцировка 1вплоидпых клеток происходьп только в присутствии партнера с противоположным типом спаривания. Ген Т(Го), чей продукт необходим для слияния клеток в процессе скрещивания, индуцируется после связывания а- или а-факторов с соответствующими клеточными рецепторами Эгот контакт вызывает также увеличение экспрессии а- или а-специфических генов в 3 — 5 раз. Таким образом, под контролем локуса МАТ находится иерархия регуляторных цепочек.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
