Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Животлые химеры. К серьезным достижениям эмбриологов следует отнести успехи в создании животных химер, т. е. организмов, у которых клетки разных тканей имеют разный генотип. Оказалось, что изолированные бластомеры или агрегаты из нескольких бластомер могут объединяться друг с другом и образовывать бластоцисты, способные к дальнейшему развитию. Могут объединяться и бластомеры, взятые у животных с другим генотигюм или даже животных, относящихся к разным видам.
Полученный в результате гибридный эмбрион после вышеописанных манипуляций может развиться во взрослое животное, у которого разные ткани будут генотипически различными. Таких животных называют аллофенными. Их можно получать также из эмбрионов, сконструированных путем микроинъекции бластомеры(ов) или стволовой клетки в бластоцисту другого животного (рис. 5.7). !50 т!асть !.
Генная инженерия т Ыко к а) + Ьлкстсмерм Э ей Ивкубврование ш трио Бдастоциста к в Г Введение в матку приемкой матери Бласто цвета Химерное потсмспю Рис. 5.7. Способы получения животных химер путем смегпения бластомеров, имеющих разныи генотип (а), или введения бластомеров или стволовых клеток (Е3) в бластоцисты„отличающиеся от пих по генотипу (б) Первым примером создания межвидовых аллофснных химер животных является гибрид овца (2п = 54) х коза (2п = 60).
Для их полугения объединяли в разных соотношениях 8-клеточные эмбрионы овцы и козы и "мозаичные" эмбрионы вводили какому-либо из этих животных (пей(Пу ег а!., (984). В наиболее удачных случаях, когда в опытах были получены жизнеспособные химеры, "мозаичные" эмбрионы содержали один 8-клеточный эмбрион овцы и три 8-клеточных эмбриона козы, а животнымреципиентом была коза. Химеры оказались бесплодными. В их крови были обнаружены эритроциты и овцы, и козы. Внешний покров имел мозаичную структуру — отмечалось чередование участков, покрытых волосом или шерстью. Двойственность свойств наблюдалась и в других фенотипических признаках.
Глава 5. Хлетлки !5! Перенос генов между видами Для того чтобы произошел горизонтальный перенос ге но в, генетический материал должен преодолеть два препятствия — барьер для проникновения чужсролной ДНК (чужДНК) в клетку и барьер для ес наследования. Эти препятствия реализуются в виде механизмов предотвращения генетического контакта между донорной и реципиентной клетками„расщепления чужДНК, исключения ее из процессов репликации и сегрегации, блокирования ее экспрессии.
Несмотря на многочисленность этих механизмов, переносы генов между видами и даже между царствами происходят (рис. 5.8). Как жс преодолеваются эти барьеры и природе? Рис. 5.8 Установленные и предполагаемые пути горизонтального переноса генов между царствами. — г — путь установлен.„— — -+ — путь предполагается Экспериментально установленным механизмом переноса генов между грамотрицатсльными и грамположительными бактериями, а также от эубактсрий в растения и грибы является конъюгация.
Перенос генов в эубактерии возможен (но не доказан) методом трансформации. Однако барьер для проникновения чужДНК в клетку преодолевается проще, чем барьер для ее наследования. Проблема рестрикции. В бактериях чужДНК, проникающая в клетки, гилролизуется (рестрицируется) с помощью специфических эндонуклеаз — рестриктаз, являющихся элементом КМ-системы, т. с. системы рестрикции и модификации (рис. 5.9). Рестриктазы связываются с двунитевыми молекулами ДНК в определенных участках (сайты узнавания) и расщепляют их на фрагменты (рестрикгы). Собственную ДНК они не разрушают, поскольку се сайты узнавания модифицируются специфическими метилазами (Агбег, Оцввоиг, 1962).
Ферменты рестрикции и модификации найдены практически у всех исследованных бактерий. Они могут кодироваться также фагами и плазмидами. 152 Часть 1. Генная инженерия /н ггто У чужДН К есть несколько возможностей избежать ')н ,'Ф ф стриктазы и метилазы конкьт гидролиза рестриктазами. Ре,, курируют между собой, но расшепляющая активность превышает метилиручогцую в среднем на два порядка. Так, если какая-либо фаговая с ДНК имеет только один сайт узнавания для клеточной ре- 1'ис.
5.9. Схема явления ресзРикпии и мо- стриктазы то зффек гивност дификации иа примере развития фатов в Е,Д !ш „... К 12 11 в С) титРованиафага наэтихклетШтам~ды К 12 и П обладают разнылся кал (в пйсдпедожении, Что КМ-систсчами, штамм С ие имеет этой сайт исходно не мстилирован) системы.
Жирная стрелка означает, что составит 10 ', если лва сайта, эффективность титрования фага рав- то — - 10 ' и т.д. Развившиена 1; тонкая стрелка указывает иа су- ся фаги в дальнеишсм титрущественное ограничение развития фага кпся на этих же клетках с зфсктивностъю равной 1 (ель рнс. 5.9). Некоторые фаз и и плазмиды обладают специальными антирсстрикционными механизмами. Например, они могут: 1) иметь спецшпьный белок, который ингибирует действие хозяйской рестриктазы; 2) кодировать метнлазу с той же специфичностью, как и хозяйская метилаза; 3) включать в свою ДНК нсобычцые нуклеотиды, нс узнаваемые рсстриктазами; 4) иметь небольшое число сайтов рестрикции и др.
Отметим также, что однонитсвая ДНК редко атакуется рсстриктазами !см. гл. 6). Поэтому фаги с однонитевой ДНК и плазм идная ДН К в процессе колп югации определенное время не доступны для них. Приблелит реляикации. Стабильное наследование чужДН К, избежавшей гидролиза рестриктазами, маловерояпю. Для этого чужДНК должна быть или стать репликоном, или интегрироваться в хозяйскую хромосому. Сошлемся на пример плазмид с широким кругом хозяев !см. гл. 3) и случай репликации сгафилококковой плазмиды в о.
сегеиздте (Сгоцгзот ег а!., 1982). Конечно, теоретически также возможно, что чужДНК приобретет оп'-сайт реципиентной клетки. Проблемарекомбинации. При рекомбинационном закреплении чужДНК возникает новый барьер — проблема коррекции неспарен- Глава 5. Клетки 153 ных оснований, которые появляются в гстеродуплексах в случае взаимодействия не полностью гомологичных ДНК.
В участках, где находятся неспаренные основания, под дсйствиел» репарируюших ферментов образ»чотся однонитевые бреши. Если соседние неспарснные основания достаточно близки, то при их олновременной репарации ца разных нитях бреши л»огут перекрыться, что пр»»ведет к двунитевому разрыву ДНК и гибели рекомбинппа (рис. 5.! О; Григорьев и др., 1978). Этот механизм является серьезнеишим препятствием для межвидовых обменов генетическим материалом (Кауюйц(ег ет а1., 1989). Ф Репарация и) б) Рис. 5.10.
Вози»ожнь»е варианты коррекции песпиренцых оснований при рекомбинации ис полпостыо гомологичных ДНК: и — послеловательная репарация; б — одновременная репарация. Неспаренность оснований обозначена расхождением нитей ДНК Проблема транскрипции. Следуюшее препятствие — экспрессия чужеродных генов. В подавляющем болыиинстве случаев — это вопрос их удачной интеграции рядом с промоторами реципиентных клеток. К настояшему времени описано только функционирование генов антибиотикоустойчивости со своими промоторами при их переносе из грамположительных бактерий в грамогрицательные. Глава 5. Клетки 155 Проблема кодовое. Из-за вырожденности генетического кода одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими кодо- нами, и зачастую ей соответствуют несколько изоакцепторных тРНК Частоты встречаемости разных тРНК в клетках различных организмов неодинаковы.
Причем, как показали исследования, эти частоты положительно коррслируют с частотами использования кодонов в клетках тех же организмов (1кепшга, 1985). У многоклеточных организмов в разных тканях предпочтительными могут быть разные кодоны и тРНК. Это обстоятельство является определенным препятствием лля трансляции в случае переноса генов между отдаленными видами и тем более царствами, поскольку в реципиентных клетках для некоторых кодонов чужеродного гена может не хватать тРНК.
Предпочтительно используемые (оптимальные) кодоны были выявлены для клеток многих видов (табл. 5.1). Интересно отметить, что сели белки в клетках синтезируются в больших количествах, то кодируюл~ие их гены состоят в основном из оптимальных кодонов (правило оптимальности кодонов). Таковыми являются, например, у Е. сор гены рибосомных белков (грl и газ), белков внешней мембраны (атрА), клеточной стенки ()рр), РНК-полимсразы (гроВ) „фактора элонпщии трансляции Тц (лбА), белка КесА и лр. Напротив, сели число молекул белка на клетку измеряется единицами (например, регуляторный белок, кодируемый геном ггрК), то доля неоптимальных кодонов в нем заметно возрастает. Геиомные перестройки Запрограммированные перестройки в ДНК вызываются сайтспецифической рекомбинацией, вследствие чего появляются детерминированные делеции, инверсии и инсерции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
