Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Они приводят к дифференцированному выражению определенных генов и даже к дифферснпировке клеток. Неконтролируемыс делении, инверсии, дупликации и инсерции приводят к трудно прелсказуемым последствиям. Закреплению полезных изменений в потомстве могут способствовать "эгоистические" гены. Дележи.
Хрестоматийным примером стал расшифрованный механизм лифферснцировки клеток животных при формировании генов иммуноглобулинов. В этом случае внутригенные делеции позволяют формировать целый ген из различных генных 156 Часть !. Генная инженерия ен 1уен сегментов. Аналогичное явление выявлено и у бактерий. Так, > нитчатых цианобакгерий АнвЬссена при азотном голодании десятая часть клеток дифферснцируется в неразмножающиеся гстероцисты. В результате двух лелсций в них восстанавливается целостность п(г'-опсронов, отсутствующая в обычных клетках, и гетсроцисты, фиксируя атмосферный азот, начинают снабжать соелинсниями азота соседние клетки (Оо)с)еп ег а7., 1985). Сходный механизм функционирует у В. аиЬЬ!В при спорообразовании (Кцп!се1 и а!., 1990).
Спора созревает внутри материнской клетки вокруг одного из нуклсоилов после несимметричной с е и та ц и и . Последовательное включение необходимых юи этого генов происходит пугем смены сигма-факторов РНК-полимеразьь Один из таких факторов, ох, кодируется расшсплснным геном еенК. В ролитсльской клетке происходит воссоединениее частей этого гена пугем делеции разделяющего их учас- тка ДНК: неактивный и8К = а8К'-(гесотЬптазе)-я8К" — ь активный ялК.
Интересно, что ген рекомбиназы, осуществляющей этот процесс, находится в дслстируемом участке. В обоих приведенных примерах дифференцированные клетки потомства не дают. Инверсии. Опишем способ регуляции внутриклсточных процессов путем обратимой инверсии небольшого генетического сегмента. У клеток Х гурЬЬнипигл одна из субъединиц флагеллина (белок жгутика) представлена двумя типами белков, кодируемых генами Н! и Н2. Клетки синтезируют белки Н1 и Н2 поочередно, причем частота переключения их синтеза, опрелеляемая по изменению антигснных детерминант, равна !О' — 1О-'.
Выяснилось, что смена таких состояний клеток обусловливается инверсией сегмента Н, размер которого 980 п.н. (8!щоп, 8!!ясгптап, 1983), Он располагается перед геном Н2 и содержит промотор (рис. 5.1!). 1 си .62 находится в том жс опероне, что и ген гЬ1, кодирующий рспрессор гена Н!. При одном положении сегмента образуется белок Н2 и репрессор гена Н!. Поэтому у клетки проявляется только антиген П2. При изменении положения этого сегмента оперон Н2-гЬ! выключается, что и приводит к смене антигснной структуры клетки. Инверсия сегмента, на концах которого нахолятся инвертированные повторы размером в 14 п.н., осуществляется с помощью белка, ген Ьья которого располагается в самом сегменте.
Аналогичная система найлена в клетках Яи~е!!л Ьоуй! и Глава 5, Клетки !57 5. с!узел!се!ас с инвертазами Р(пВ и Р!п0, соответственно (Топнпайа е! а!., 199!). Н! Ф в) "' 'о р й1 Н2 1 +и Ьщ — — — — лвл "— -- ~в Н ги Н2 ~~'. е Н о р ир1П Н1 Рис. 5.11. Регуляция смены аптпгенной структуры с помошыо инвертируемого сегмента Ну клеток Юа!толе!!а: а — ген Н2 включен, геи Н! выключен; 6 — геи Н2 выключен, ген Н! включен. и — инвертированные повторы сегмента Н; р — пролютор; о — оператор, штриховая стрелка указывает па саят действия продукта гена г!1! Напомним, что регуляция активности генов путем инверсии генного сегмента описана также у фатов Р! и Мп, дефектного профага е14 и плазмиды р15В (см.
гл. 4, рис. 4.11). Интересно отметить, что инвсртазы С!и, Глп, Р(п, Н1п, М1п, РгпВ и Р1п11 гомо- логичны на 60 % и взаимно заменяют друг друга. Отмечено нх значительное сходство с рсзольвазами транспозонов ТпЗ-семейства (см. гл. 2), но комплслгентация функций в данном случае отсутствует. Инвсртазы и рсзольвазы составляют одно семейство сайтспецифических рекомбнназ.
Другое семейство включает в себя интсгразы лямбдоидных фагов, Сгс-рскомбиназу фага Р! (см. гл. 4), Г1 Р-рекомбиназу 2-микронной плазмиды дрожжей (см. ш1. 3) и Р1гп-инвсртазу Е, со!1, действие которой приводит к обратимому изменению структуры пилой (АЬга11ат е! а!.„) 985). Смена двух состояний поверхностных антигснов под управлением инвсртаз Е(гп и Н1п способствует повышению устойчивости бактерий против иммунной системы животных. Выявлены и другис мсханизлгы, направленные на достижение этой жс цели (см. обзор Вогз1, Огсауек 1987).
У Жеигег!а Колсгт71оеае вариабсльность структуры пилина достигается путем присоединения к его начальной константной части одной из многих различных копий 153 Часть!. Генная инженеяня 1н Мъо концевой части, а разнообразие в структуре основного поверхностного антигена происходит благодаря смене рамки считывания его нескольких генов. Напомним также, что у спирохет йоте((а анти- генная вариация обеспечивается рекомбинацисй мсждулинейными плазмидами (см. гл.
3). Инсерцикс Случаи направленных инсерций генов в еиазмидные ДНК рассматривались в гл. 4. Генетические элементы — интегроны, способствующие этому, в клеточных хромосомах пока не описаны. Неконтролируемые гепомные перестройки. В предыдуших главах уже отмечалось, что с помощью плазмид и фагов можно осуществлятьтране поз ици ю генов сих собственными промоторами. Локализация гена в чужом для него окружении не отражается, как правило, на его функционировании. Отмечено лишь лве причины, из-за которых уровень транскрипции может измениться в 2 — 3 раза. Во-первых, число транскринтов определенного гена зависит от его положения относительно бактериального оп'- сайта: чем ближе к огйсайту, тем их больше (эффект дозы гена).
Во-вторых, при перемещениях генов с их инверсией следует учитывать, по эффективность транскрипции гена зависит от его ориентации относительно направления движения рспликационной вилки: большинство активно транскрибируемых генов расположены в направлении их репликации. Последствия дупл и к аци и ген о в или дел е ц и й в большинстве случаев легко предсказуемы: возможности функции увеличиваются или теряются.
К сложным гюследствиям приводят и н во р с и и значительных сегментов ДНК. Выживаемость клеток с инверсией локусов в одной трети хромосомы около района терминации репликации серьезно пони- жена. Возможно, это вызвано необходимостью сохранить структурно этот район из-за его предполагаемой связанности с мембраной и участия в процессе сегрегации ДНК. Эавистическал ДНХ. Борьба за выживание — основной движитель биологической эволюции. Она происходит и на молскузирном уровне, о чем свидетельствует существование "эгоистических" генов.
Под этим названием подразумевают целый класс генетических элементов или группы генов, которые, находясь в Глава 5. х'гетки 159 клетке, "заботятся'* прежде всего о собственном сохранении в ряду поколений. При этом они часто вступают в конфликт с организмом-хозяином. Некоторые такие явления уже описывались в книге. Наиболее яркий пример — индуцибельные профаги умеренных фагов (см. с.
110). Они могут находиться в лизогенных клетках в течение сотни генераций, не причиняя им вреда и даже в чем-то обеспечивая им преимущества по сравнению с нелизогенами. В неблагоприятных для клеток условиях профаги индуцируются, давая фаговое потомство и убивая клетки. Эгоистично и поведение плазмид, обладающих системами постсегрегационной гибели бесплазмидных клеток (см. с. 73). Здесь формой "заботы" о себе является обеспечение сохранившихся клеток питательными ресурсами, которые иначе были бы использованы бесплазмидными клетками. Эгоистические гены при мейозе у зукариот приводят к предпочтительной передаче в потомство собственных аллелей, вызывая гибель зигот, не получивших эти аллели (Веепзап ег а1., !992).
Эгоистичными являются и системы рестрикции-модификации класса 11 (см. с. 164), гены которых могут находиться в геномах плазмид, фагов и даже клеток. Поддержание зтих систем важно для защиты клетки от проникновения чужДНК. Оказалось, что клетки, потерявшие ВМ-систему, погибают, способствуя тем самым ее сохранению в популяции (Ха)го ег а1., 1994).
Механизм заключается в том, что метилаза, оставшаяся в клетке гюсле потери или инактивации ВМ-системы, не успевает прометилировать множество сайтов на хозяйской ДНК, а рестриктазе достаточно расщепить один сайт, чтобы погубить клетку. Иногда гибель клеток при определенных условиях программируется содержащимися в них "эгоистическими" генами. В таких случаях их альтруистическое поведение продиктовано необходимостью обеспечить выживание более "удачливых" копий.
Известно, например, явление самоубийства кчеток, зараженных определенным вирусом, что не позволяет ему развиваться и инфицировать соседние клетки (Чапх ег а1, 1994; Ъ'агпзо1шзку, 1995). У прокариот примером подобного типа реакпии служит явление исключения фагов, программируемого резидентным профагом или плазмидой: ген оЫ фага Р2 исключает развитие фага ), ген р1УР- плазмиды — фага Т7, гены гехАВ фага 1. — многих других фатов. 160 Часть 1. Генная и>икенерия >и е>го ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕННЯ 5.1. По гвму лля процесса упаковки бактериальной ДНК в пуклсоил необходимо нейтрализовать ее отрипателы<ый заряд? Как это лелается? 5.2.
Каков биоло> ичсский смысл того, что дифференцировавшисся клетки (в приведенных примерах гетероцисты Алей>пела и материнские клезки В. ни<>гй>у) не дают потомства? 5.3. Составьтс план эксперимента по картированшо нового гена Е сой в прслелах -!О мип карты (используйтс штаммы и маркеры, см. рнс. 3.1О). 5.4. Составьтс план эксперимента по картнрованию нового гспа Е сой в пределах -1 мин карты, очная задание 5.3 выполненным 5.5 Почему у дрожжей в гаплоилных клетках типа а нс фупкцпониру>от и-специфические гопы? Обратима или пет смена типов спаривания у дрожжей? 5.6. Для каких целей служат запрограммироваш<ыс геномпые перестрог!ки? 5.7.
Какие проблемы можно решать с помощью соматических м!б!)илов? 5.3. Составьтс план эксперимента по конструированию гибрндомы с определенной специфичностью. 5.9. Охарактеризуйте приролпые механизмы, препятствую>цие л<ежвидовым обменам генами. 5.<О. В чем зактючастся социальная опасность работ по клопировани>о человека? ЧАСТЬ ХЕ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Пх( 71ТКО Для создания химер — организмов, обладающих необычными сочетаниями признаков, разработаны методы манипулирования генами гд игго. Основнои "инструмснтарий'* этих методов — прежде всего ферменты, действую|див на ДНК, векторы — переносчики генов, а также синтетические олигонуклеотиды (линкеры, адаптеры, праймеры, зонды и т. д.), с помощью которых объединяют, синтезируют, отыскивают и анализируют гены.
Многие из перечисленных препаратов имеются в готовом виде. В стандартном генно-инженерном эксперименте ьл игго в векторные молекулы с помощью ферментов встраивают определенные гены или фрагменты чужеродной ДНК (чужДНК). Полученные молекулярные гибриды называют рекомбинантными ДНК (рекДНК). Конструирование молекулярных химер ~л глго включает ряд разноплановых, параллельных и/или последовательных операций, которыс заканчиваются введением рекДНК в реципиентные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
