Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 25
Текст из файла (страница 25)
4 6 ДНК фага !Ч!5 по строегипо похожа на ДНК Фага Л, а его линейный плазмиднь>й профаг с ковалентно замкнутыми концами также псрмутирован, как и профаг Л. Предложите обобшенную молель Кэмпбелла лля образования профага 1ч*!5. 4.7. Опишите спссобы использования Фага Л в качестве вектора для мани ну»яиий генами ьч мик 4.8. Для какой цели и квк используются вра>цюошпсся сегменты в геномах фатов Р1 и Мц? 4 9. Какие изменения в регуляторных цепях генома Фага Л иеобхс>- димо сделать, чтобы "превратить" его в плазмиду? 4.10, В пробирку добавлены бактерии и фагн в одинаковом количестве. Какая доля клеток будет инфицирована в предположении, что все Фаги адсорбировались на клетках? Глава 5 КЛЕТКИ Клетки являются простейшим уровнем организации живого, способным к самовоспроизведению. Вне клетки все ранее рассмотренные генетические элементы — транспозоны, плазмиды и вирусы — инертны.
В генетической инженерии клетки играют двойную роль: как непосредственный объект генного конструирования, когда сама клетка выступает в новом качестве, или как средство для клонирования генов, которые исгюльзуются в других организмах. Цель данной главы — познакомить читателя с некоторыми аспекгами организации клеточных геномов, которые призваны способствовать диверсификации клеток лаже в прелелах одного вида и которые можно рассматривать как примеры природной генной инженерии.
Речь идет о механизмах межвидовых обменов генами и о геномных перестройках у ключевых объекюв генетической инженерии, и прежде всего, у наиболее изученного из них — Е. сад. Несомненно, выделение именно этих аспектов носит искусственный характер, но оцо соответствует задачам учебника и демонстрирует возможности, открывающиеся перед геномной инженерией. Напомним, что все живые организмы относятся к двум надцарствам — прокариотам и эукариогам. Надцарство прокариот включает два царства — архебактерии и бактерии, а надцарство эукариот — три царства. животные, растения и грибы.
Прокариотические клетки, в отличие от эукариотических, не имеют организованного ядра. Их ДНК в клетке находится в составе нуклеоида, содержащего также РНК, белки и фракции клеточной мембраны. Второе важное структурное отличие — отсутствие у прокариот реальной компартментализации функций: за исключением рибосом, у них нет ор~анелл и эцдогглазматического ретикулома.
Структурно различны и механизмы репликации и сегрегации хромосом. Структурно по-разному органи:юваны механизмы транскрипции и трансляции (см. табл. !.!). 130 Часзь 1. Генно» инзненери» ьн ьтио Эукариотические клетки подразделяют также на вьющие (животные, растительные) и низшие (грибы, включая дрожжи). Существенно различны таксономических группы прокариот — эубактерии и архебак~ериьл Послелние характеризуются необычностью среды обитания — очень высокая температура, засоленность и другие экстремальные факторы, т. е. там, где "нормальная*' жизнь невозможна.
Прокариотические клетки Организация гепгмга. Прокариотические клетки могут содержать от одной до нескольких десятков хромосом в зависимости от стадии и скорости их леленьи. Однако зги клетки относят к гаплоидным орин низмам, так как их хромосомы являются копиями исходных молекул ДНК, и потому их генетический материал однороден. Традиционное представление о бактериальном геноме как об одной кольцевой молекуле ДНК сегодня пересмотрено.
Были обнаружены линейные хромосомы у В. Ьиз8йю~еьз'(Геп1оигз, Ваг(зонг, 1989), у Х соейсо!оси Х (ьтс!от (Ып ег а!., !993), у ВЬог?ососсиз Язсьапз (Сгсзр! ег а!., 1992). В клетках А. гизпе~ас(епз геном представлен одной линейной и одной колы !евой хромосомой. Имеются и другие комбинации молекул ДН К (см.
обзоры !997, НйтпеЬ~ж!ь Тй!у, 1991; Ко(зггз). Размер бактериальных ДНК колеблется в пределах от 0,6 (у микоплазм) до 1О (у миксококков) миллионов пар нуклеотидов (млн. п.н.). Некоторые виды бактерий имеют исключительно большие плазмиды (мегацлазмиды), длина которых сравнима с длиной хромосом. К ним, в частности, относятся симбиотические виды Юи~ойит, их плазмилы содержат информацию об азотфиксации и об образовании на корнях растений узелков (гены пК 7?х и поь?). У Я. гп~о!й размер такой плазмиды составляет 1,6 млн.
п.н. Интересно отметипн что у видов а?едгьеда гомологичные гены п(гимеют хромосомальную локализацию. Отсюда возникает вопрос, каков тот критерий, когда мегаплазмиды, содержащие функционально важные гены, следует называть также хромосомами? Например, клетки ВЬоВоЬасгег зрйиегои(ез имеют кольцевые ДНК длиной 3 и 0,9 млн. п.н. Первая содержит все лажные гены, а вторая — только некоторые их копии.
Обе ДНК названы хромосомами (Вцьиапго, Кар!ап, !989). В бактериальных хромосомах органично соединеньь две сущности — физическая и информационная. Физически они пред- Глава 5. Кмлжи 131 ставляют собой сложный динамичный белково-нуклеиновый комплекс — н у к л е о и д, состоящий из независимых суперскрученных доменов. Домены по-разному реагируют на изменения физиологических условий, способствуя включению нли выключению определенных генов или групп генов путем модификации своей вторичной структуры или путем прямого взаимодействия отдаленных генетических локусов с помощью специфических белков.
Информационно бактериачьная хромосома представляет собой мозаику генетических элементов, собранных из многих источников. Параллельно в процессе эволюпии ДНК изменялась и продолжает изменяться благодаря мутациям (замена оснований, небольшие вставки и делеции, перестройки), внутривидовым рекомбинациям, межродовым и даже межтаксонным переносам генов. Всл эта мозаика и механизлгы ес возникновения прошли через сито отоора — выдерживания баланса между преимушествами измененийй и необходимостью сохранения генетической стабильности. Есчь ряд факюров, которые лимитируют изменения. Это гибель рекомбинантов из-за работы репарирующих ферментов в случае неполной гомологичности рекомбинируюших хромосом.
Это различия у разных видов в нуклеотидном составе ДН К и использовании колонов. Это запрет некоторых типов гсномных перестроек в районе терминаторов репликапии из-за необходимости выдерживать равенство длин реплицирующихся в разном направлении плеч ДНК. Наконец, не следует забывать о существовании причин, закрепляющих положительные свойства, приобретенные клеткой, на уровне популяции. Перечисленные факторы, казалось, носят универсальный характер, и поэтому ожидалось, что уровень внутривидовой вариабельности в последовательностях нуклеотидов будет одинаков у разных родов бактерий. Однако измерения показали широкий диапазон значений этого параметра — от минимального у микобактерий и риккетсий ло крайне высокого у стрептомицет и ризобий.
Причина этого явления пока неизвестна. Хлевки Е. со6. Кольцевая ДНК этих клеток, реплицирующаяся в тета-Форме, содержит 4700 т.п.н. Она покрыта многими белками, основным из которые является гистоноподобный положительно заряженный белок НС. Контурная длина ДНК (около 1 мм) в 1000 раз превышает длину клетки, поэтому эффективное 132 е1асть 1. Генния иняеенеяня гн цен функционирование генома обеспечивается определенной укладкой (компактизацией) ДНК в нуклеоид. Нуклеоид состоит приблизительно из 50 топологически самостоятельныхдоменов, в каждом из которых суперскручивацие ДНК с гюмощью гиразы и ее релаксация под действием топоизомеразы 1 происходят независимо друг от друга. В предыдущих главах уже отмечалась регуляторная или структурная роль небольших нуклеотидных повторов, с которыми связываются и через которые действуют определенные белки.
Они важны для инициации репликации ДН К и экспрессии генов, для процессов рекомбинации и репарации. У бактерий кишечной группы выявлены также рассеянные по всему геному высокоповторяющиеся последовательности, представляющие собой мозаику из несовершенных палиндромов Р() (ра!1пдгощ)с ипй) и консервативных сегментов (Сйвоп ег а)., 1991). Эти элементы, названные В1МЕ (Ьасгепа) )пгегврегзес3 шова)с е1еп1епгз), всегда располагаются в межгенных участках; в геномс Е. со)1 их насчитывается около 50. Роль В1МЕ до конца не понятна. Во всяком слу ие показано, что палиндромы Р11связываются сДНК-полимеразой ! и гиразой и что они участвуют в образовании нуклеоида, терминации транскрипции и в геномных перестройках.
К настоящему времени полностью секвенированы ДНК клеток Е сой дикого типа (штамм МС!655) и лабораторного штамма Е. со(1 К-12; в геноме последнего насчитывается 4638858 п.н. (В!а1щег е! а(, 1997). Для штамма %31!0 сосгавлсна подробная физическая карта (КоЬага, 1990). Между этими и другими проанализированпыми шгаммами Е соЕ К-12 выявлены существенные различия в характере геномных перестроек — инсерций, делений, повторов и инверсий (см, обзор Кгавл)ес, Вйеу, 1990). Даже в разных линиях одного штамма %3! 1О за несколько лет раздельного культивирования накопились существенные различия (!)ап1е)з, ! 990).
Анализ природных изолятов Е. соя путем исслелования электрофоретических свойств нескольких белков выявил к л о н а л ь— н у ю с т р у к т у р у п о и у л я ц и й: 1691 штамм был подразделен на три подвида (%)ппапт е! а!., ! 983). Зго, казалось, свилетельствовало о низком уровне рекомбинационных обменов в природе у этих клеток и об их репродуктивной изоляции. Но нуклеотилный анализ области три~пофанового оперона 36 штаммов из той жс коллекции, подтвердив наличие клональности, вскрыл, одна- Глава 5. Клетки !33 ко, присутствие в этой области вставок из нескольких сот пар нуклеотидов, происходяп!их из других подвидов (Мй)ггпап, Впс(лев, 1993).
Таким образом, горизонтальный поток генов у Е со((значителен, и ее геном является мозаичным. Перенос генов, как уже отмечалось в предыд)л них главах, осуществляется плазмилами и фагами. Ориентация генов нахромосоме Е. со!!не являетсяслучайной, активно транскрибируемые гены расположены по направлению движения репликационных вилок. Очевидная причина— свести к минимуму столкновение РНК- и ДНК-полимераз. Среди 97 генов, имеющих отношение к трансляционному аппарату, 92 гена ориентированы именно таким образом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
