Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 21
Текст из файла (страница 21)
РазвитиюфагаЛ>в<>" препятствует также присутствие в клетках экзонуклеазы О)<( фага Р2 108 Часть 1. Генная инженерия т ргио (Яр(+-фенотип), но фаги ХгетГ титруются на лизогенах с профагом Р2 (Яр(=фенотип). Причина этого эффекта не выяснена. Ранний период развития фага завершается либо появлением в цитоплазме ()-ттродукта, контролирующего траискритщию поздних генов, либо интеграцией профага в бактериальную хромосому. Сгрукгура и Структура п! Структура Пг а>ср л т Рис.
4.2. Морфогенез фата Л: а — репликация ДНК в сигма-форме; б — этапы сборки головки„в — этапы сборки отростка; г — зрелый фаг Заключительный п озд н и й не р и од развитти фага начинается с транскрипции поздних генов Я вЂ” Я~ и Ати1 — У с промотора р'К (рис. 4.1гг). Гены Ати1 — Л1 содержат информацию о синтезе белков пьтовки и ее сборке, а гены У вЂ” Хобеспечивают образование отростка фата. Сборка головки фага протекает поэтапно (рис. 4.2). Сначала вокруг центрального ядра, состоящего из белков ярХпЗ, ярВ и арС, собирается сфера из основного белка головки ярЕ (структура 1). Далее центральное ядро удаляется с пом<пцью бактериального продукта СггоЕ, и в образовавшуюся структуру 11 начинает упаковываться ) ДНК.
На этом этапе белок Иур! способствует расширению головки фага (структура 111), а белки яр)чв1 и ярА "вырезают" фаго- Глава 4. Фаги 109 вые геномы по сох-сайтам из конкатемерной Х ДНК. Головка, содер- жащаяДНК, фиксируется белком яр!? (структура 1У), и к ней с помощью белков яр% и ярЕП присоединяется отросток (его морфогенез осуществляется независимо). Сформировавшийся фаг выходит в среду после лизиса клетки, осущеспгяяеьгого продуктами генов Я, й и Ж Вопрос о пупгх развития фага (литический или лизогенный) решается в раннем периоде. Установление лизогенного соспжния в клетках определяется двумя независимыми процессами: подавлением транскрипции ранних оперонов, которое осущесгвляется репрессором— продуктом гена с! через операторы оЬ и оВ (они перекрываются с промоторами р1.
и рй), и интеграцией фаговой ДНК в бактериальную хромосому с помощью фагового белка !пг и бактериальпого белка Н(шА Оба процесса регулируются продуктами ~снов сП и с!П, способствующими увеличению концентрации белков С! и 1пг путем включения транскрипции генов с! и ?лгс промоторов согпветственно рЕ и р1.
Продукт гена сю, определяющий литический путь развития фага ?, являегся его вторым репрессорным белком, действующим нате же операторы, что и репрессор С1. В процессе конкуренции с последним Сп?-белок снижает через операторы оЬ и оВ уровень синтеза ранних белков, что необходимо для максимальной экспрессии поздних функций фага, и выключает транскрипцию гена с1. Таким образом, усшновление лизогенного состояния в клетках обусловливается левосторонней транскрипцией с промоторов рЬ, р! и рЕ, а литическое развитие фага — правосторонней транскрипцией с промоторов рй и р'В.
В итоге "судьба*' фага определяется соотношением концентраций продуктов С!1/СП! и Сто, которое в свого очередь зависит от физиологического состояния клетки в момент ее инфицирования. Лизогенное состояние закрепляется транскрипцией гена с1 с промотора рМ. Синтезируемый белок-репрессор С! связывается с операторами оЬ и ой и полностью блокирует транскрипцию ранних генов (см. рис. 4.
1,д), подавляя вегетативное развитие фага. При инактивации репрессора в лизогенных клетках инлуцируется развитие профага по описанным ранее трем этапам, причем до появления в раннем периоде белков 1пг и Х)з транскрипция и первый раунд репликации профага происходят в составе бактериальной хромосомы. Индукцию ?-лизогенов осуществляют облучением культуры легкой дозой УФ-света Этот метод основан на природном свойстве многих профагов приступать к литическому развитию, если клетка оказы- ! !О Часть !. Генная нниеенерня гн нее лается в условиях, неблагоприят ~ ~их для ее существования. 11ри действии УФ-света в клетках активируется КесА-белок, которгяй способствует автопротеолизу репрессороя, контролирующих систему репара- цииДНК.
Репрессор С1 также расщепляется, что приводит к индукции профага ) . В лабораторной практике более удобна термоиндукция (прогревание кульзуры лизогенных клеток при 42 С), которая возможна при наличии в гене репрессора термочувствительной му!ации (обычно с!857). Если профаг переносится каким-либо механизмом (конъюшция, трансфекция, трансдукция фатом Р ! ) в нелизогенную клетку, то из-за отсутствия белка-репрессора в ней начинается развитие фаз. Это явление получило название зигопюй индукции. Опо присуще большинству умеренных фатов, даже неиндуцибельных.
Механизм лизогеиии. Со!ласно Кэмпбеллу (Сашрбе!1, 1962), интеграция 7 ДНК в бактериальпую ДНК происходит через специфические аи-сайты с помощью фагового продукта 1п! и продукта бактериального гена ГнхлА (рис. 43п,б,в). Фаговый и бактериальпый' сайты устроены сходным образом. Их основу составляют одинаковые последовательности (О) из 15 п.н.„фланкированные участками определенноп> строения. Эти участки у фагов обозначаются Р и Р', у бактерий — В и В', так чзо строение агнсайтов выражается: аиР = РОР' и пиВ = ВОВ'.
Участки Р и Р' состоят соответственно из !45 и 75, а В и В' — из 3 — 5 п.н. Белок !!т!, будучи топоизомеразой типа 1, осуществляет в центральных участках О фагового и бактериального аи-сайтов поочередное разрезание нитей ДНК. В результате образуклся ступенчатые двунитевые разрывы, именлцие однонитевые комплементарные участки из 7 нуклеотидов. При взаимном обмене такими концами между сайтами РОР' и ВОВ' фаговая ДН К встраивается в бактсриальную хромосому, причем па концах профага оказываются рекомбинаптпые ии-сайты ВОР' и РОВ'. В случае индукции своего развития профаг исключается через эти сайты из бакгериальной хромосомы с помощью белков 1п! и Х!з. Иногда, с час гатой около 10, исключение профага осуществляется по случайным сайтам с захватом бактериальных генов, располагаюгцихся слева или справа от него. Эти гены локализуются в фаговой ДНК соответствешю слева или справа от аи-сайта (рис.
4.3,г). Образующиеся в резулгп ате фаги ! газьшают трансдуцирующими. Для образования трапсдуцируаллих фагов с определенными бактериальпыми генами необходимы два условия — близость рас- Глава 4. Фаги 111 положения данного гена к месту посадки профага (чем ближе, тем с большей вероятностью он включается в трансдуцирующий фаг) и сохранение в геноме зрансдуцирующего фага со!-сайта (необходим для упаковки Х ДНК в фаговую головку).
Молекулы ДНК, длина которых превышает длину Х ДНК более чем на 5 — б %, не упаковываются в головку. Поэтому включение бактериальных генов в фаговый геном обычно происходит при потере части фаговой ДНК, что вызывает дефектность трансдуцирующих фатов. А ° ' ы а) , ~'сш Ь г — '- РОР' го)АВ падА агап аа! сЬЮ ря! дщ~ Ыо сгги !а!паша ~ ~ Х)а+Ля аа! сы!З ра! ВОР' Ы! сШ Х с1 В А 1 Ь РОВ' Ыо осгв г хазы Ф Хрыо А аа! сЫР ра! ВОР Ьа сн! Хс1 В ! — — Л вЂ” — — ~-, — -,—,, — — -Л ~СФ г) А 1 Ь РОВ' Ью Хс! В г::::::::::::: юю Л Хрыо Рис.
4.3. Схема интеграции ДНК фага Л в бактсриальиую хромосому и механизм образования транслуцирующих фатов: а — кольцевая ). ДНК; 6 — учасюк бакгсриальиой хромосомы около сайта интеграции профага ВОВ"; в — профаг с прилегающими бактсриальными генами и способы его неправильною исключения; г— трапслуцирукяцие фаги, дефектный ()г)ха)) и жизнеспособный ()«рь!о) Почти все гены фага )., несущественные для его вегетативного развития, группируются вместе по обе стороны от ап-сайта в областях Ь и !лГ-с1П. По этой причине они располагаются на обоих 1!2 Часть !. Генная инженерия сн игео концах профага.
Замена этих генов на чужеролную ДНК приводит к образованию жизнеспособных трансдупирующих фагов. Так можно получить, например, жизнеспособные трансдуцирующие фаги типа ЛрсЬЛЭ (р обозначает жизнеспособность), включающие не более !О т.п.н. бактериальной ДНК, и типа ЛрЬ(о„где чужеродный фрагмент ДНК не превышает 8 т.п.н. В дефектные трансдуцирующие фас и типа Лс)яа1 (д обозначает лефектность) вместо всех генов левой части фагового генома включается до 25 т.п.н. чужеродной ДНК. С другого конца профага гены Гнс-е! можно заменить фрагментом бактериальной ДНК длиной до 12 т.п.н.
(При этом образуется трап сдуцирующий фаг Лс)иигВ.) Уменьшение длины заменяемой ДНК в фаге Лс!иргВ по сравнению с таковой в фаге Лс!яа1 обьяспяется необхсдимостью сохранения промотора РВ и генов Р и Р, осуществляющих автономную репл икацию фаговой ДН К. Получение необычных тоапсдуцируеоисих суагов. Из приведенных данных о размерах фрагментов ДНК, которые могуг быть включены в фаговый геном, следует, ч.го фаг Л может трансдуцировать гены, улалепные от алВ-сайта не более чем на 1Π— 20 тзьп, Чтобы расширить спектр транслуцирующих фагов, бьии разработаны метолы сближения бактериальных асс-сайтов с вьщеляемыми генами.
Наиболее простым является метод леле ци й, заключаюц!ийся в удалении части ДНК между ап-сайтом и искомым геном. Например, оперон со1АВ находится на расстоянии приблизителыю 25 т.п.н. от аиВ-сайта (см. рис. 4.3,6), и поэтому нс может включиться в трансдуцирующий фаг. Такая возможность появляется после удаления генов пас(А — агоΠ— ЬХ~1 — еНГ) (около 15- т.п.н.), разЛеляющих оперон го1АВ и аиВ-сайт, в результате чего можно выделить фаг Лго1АВ. Ыетол лелеций используется и лля получения жизнеспособных зрансдуцирующих фагов вместо дефектных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
