Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Метилазы разделяют на те же классы, что и соответствующие им рестриктазы. Метилазы класса П исполшуют обычно для модификации ьл >ягп> сайтов узнавания с целью защиты последних от действия одноименных рестриктаз. Кроме того, их приме>тают лля увеличения специфичности действия рестриктаз, имеющих альтернативные сайты узнавания. Например, из четырех Ата1-сайтов 5'-СРуСГ>РвГ1-3' после обработки ДНК метилазой ОраП (5'-СССО-3') оказывается защищенным сайт 5'-СССООО-3', а после действия метилазы Таа) (5'-ТСОА-3') защищается сайт 5'-СТСОАО-3'. Совместное действие обеих метилаз еще более увеличивает специфичность действия рестрнктазы Аха1.
Олинаковые сайты узнавания в разных контекстах различают с помощью соседних с ними нуклеотгшов, если зги сайты частично перекрываются с сайтами узнавания друпвг КМ-систем. Если, скажем, ДНК обработать метилазой Тац!, то из многих ее Есор'-сайтов сайт 5'-ОАТ.1АТС-З' в последовательности 5'-ТСГ>АТАТС-3' не будет расщеплен рестриктазой ЕсойЪ', поскольку именно тот же нуклеотид модифицируется одноименной с ней метилазой. У клеток Е.
сой известны две метилазы, Наш и 13сгп, не связанные с КМ-системами. Первая метилирует аденин в тетрануклеотиде 5'-ОАТС-3', а вторая — внутренний цитозин в последовательности 5'-СС(А/Т)бб-3'. Иметь представление о них необходимо, так как ДНК, выделенная из этих клеток, не расщепляетсл (полностью или частично) теми из рестриктаз, чьи сайты узнавания перекрываются (полностью или частично) с вышеуказанными сайтами метилировання (табл. 6.3). Например„ДНК, изолированная из Ваш" клеток, полностью устойчива к рестриктазам МЬо! и 1ИеП. Впрочем, у ). ДНК метилировано только около половины возможных сайтов, что, по-видимому, объясняется недостатком времени для ее модификации до упаковки в головки. Напомним !акже, что некоторые плазмиды, выделенные из !3аш', не могуг трансформировать г)аш клетки.
Причина — блокирование второго раунда репликации, что является следствием возникающей после первого раунда полуметилированности плазмидных г/аонсайтов около их ол'-сайтов. Отметим, кстати, крайне редкое свойство рестриктазы .0рл1 и ее изошизомеров: они расщепляют только метилированную ДНК в сайте 5'-ОА 1ТС-3'. Ражип+: нерасшецляемая последовательность Псш+: нерасшепляемая последовательность Рестрик- таза Рестрик- таза сяиааяАгчсс ТббССАОО ьеесееа б б(А~ Г) СК:(Л/Т) ОС ссг аггее ООХСС(Л/Г)бб ссмаее АООССТбС Ага!1 ВаЛ Еае! Есо471 Есор!1 Еаи961 Ест/1 Еги! Примечание. Полчеркнуты сайты узнавания указанных рестриктаз. Шрифтом выделены метилируемые основания. АссП1 Вой с/а!1 НрЬ1 МЬо! МЬо! М/1! АаеП гуго! Так! ХЬа1 Глава 6.
Ферменты геиетической инженерии 173 Таблица 6.3 Влияние Влзп и Вела метнлировання на расщепление ДНК различными рестрнктазами ТССООАТС ТОАТ(:А АТСОАТС ООТОАТС САТС ОЛЛОАТС СААОАТС ОАТС ОАТСОСОЛ ТЯЫТС ТРА ОАТС 174 Часть П. Генная ллженерия ~и итго ДНК млекопитающих и высших растений часто содержит остатки 5-мстилцитозина в СО-последовательностях. Такая ДНК не расщепляется теми из рестриктаз, которые имеют подобные последовательности в сайтах узнавания и чувствительны к такому характеру метилирования. К ним относятся, например, рестриктазы НЬа! (5'-ОСОС-3'), Нла11 (5'-ССОО-3'), Ха)! (5'-ОТСЖАС-3') и ХЬо1 (5'-СТССАС-3').
Такие последовательности можно расщепить, используя изошизомеры с другим типом метил ирования. Например, сайт 5'-ССОО-3' атакуется ресгриктазой Мзр! (5'-ССОО-3'). ДНК-лигазы Разнообразные генетические процессы (репликация, рекомбинация, репарация) сопровожлаются появлением в двунитсвых молекулах ДНК ников, т. е. однонитевых разрывов. В таких молекулах 3'ОН- и 5'р-концы разорванных полинуклеотидных цепей удерживаются вместе с полюшью водородных связей с комплементарной нитью. Ферменты, объединяющие полобныс цепи путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклсотилами, названы ДНК-лигазами. Они являются второй по важности в генетической инженерии группой ферментов.
Наибоасе изучены ДНК-лигазы клеток Е, со6 и фага Т4 с молекулярными массами, соответствснно, 74 и 68 килодальтон. Энергию, необходимую для образования ковалентных связей, эти ферменты черпают у кофакторов — макроэргов !4АТ)' (никотинамидадениндинуклеотид, бакгериальная лигаза) нли АТР (фаговая лигаза). В обоих случаях ферменты аденилируются, а затем переносят АМР на 5'р-концы полинуклеотидных цепей в местах разрывов, что сопровождается восстановлением макроэргических пирофосфатных связей. Запасенная таким образом энергия тратится на образование фосфодиэфирных связей межлу соседними 3'ОН- и 5'р-концами, что приводит к "залечиванию" ников и освобождению АМР: Глава б. Фери~ентм гелетической инженерии 175 ЗОН~ 73р И-М-)4-) 1-И )4-1 1-Н-М-)4., ~УР (АТР) И-Ж-) 1-1М-(~-Х-Х-М-)~-Х...
3'ОН~ /5'-АМР + МА)3 (АТР) ...М-Н-Х-)ч-14 М-11-Ы-Н-Х... ДНК-лигаза )4 1,1 74 Н )4 ~ 11 Н ~, 11 > ...Н-П-)4-Н-Н-) 1-) 1-)4-) 1-Н,. + р „.Н-Н-1 (-)4-) 1-Ы-) -М-1~-1 1., + АМР ДНК-лигазы ведут эту реакцию на разных субстратах, связывая даже дезоксирибо- и рибонуклеотидные цепи. Фаговая лииза может обьединить и две рибонуклеотидные цепочки, действуя как ГНК-лигаза, но в отличие от последней она "работает" только на матрицах. Возможными матрицами в реакциях лигирования выступают комплементарные нити ДНК или РНК. Лигаза фага Т4 (и бактериальная лигаза с крайне низкой скоростью) осуществляет еще одну реакцию — соединяет двунитевые фрагменты ДНК, содержащие ровные концы, образуя фосфодиэфирные связи в обеих нитях.
Скорость этой реакции на два порядка ниже скорости вышеописанной реакции. Бактериальную ДНК-лигазу используют для "сшивания" (лигирования) рестриктов, имеющих липкие концы. Оптимальная температура лигирования ДНК в никах — 37 "С, но при этой температуре энергии водородных связей между липкими концами рестриктов недостаточно для их удержания в совместном комплексе в момент реакции.
Поэтому лигирование рестрикгов проводят при пониженных температурах (4 — 12 С). ДНК-лигаза фага Т4 незаменима в реакции объединения двунитсвых фрагментов ДНК, обладающих ровными концами. ЭФФективность лигирования зависит от структуры объединяемых концов, даже если они оба липкие или ровные. Скорости лигирования липких концов у фрагментов ДНК плазмиды рВК322 (см. гл. 7), образованных различными рестриктазами, снижается в последовательности: Н(лдИ! >Рзг) > ЕсоК1 > ВатН1 > Лай, причем Н(лЛП-концы лигируются в 10 — 40 раз быстрее, чем Яа)1-концы. Скорости лигирования ровных концов меняются так: 178 Часть и Генная и>неселения >и >Лт Отсугсп>ие в кленовском фрагменте 5' — >3' экзонуклеазной активности позволяет использовать его для заполнения нуклсотидами выступюощих олнонитевых 5'-концов, образующихся при ступенчатом разрезании ДНК рсстриктазами.
Например, при использовании знлонуклеазы ЕсоК1 реакция протекает слелующим образом: 5'- !ТААС> ХХХХХХС-3' 3'-СХХХХХХСЛМТ-5' — ' — > , 5'- ГГЛАС~ХХХХХХСТТАА-3' — ' — > 3'-ААТГСХХХХХХС>АЛТТ-5' Таким способом в концы фрагме>пов ДНК можно вводить радиоактивную метку, причем при желании можно помсппь только один конец, используя для этого подходящий меченый е(ХТР.
Например, если фрагмс>п имеет 5'-выступающие концы, полученные действием рестриктаз ЕсоК1 и Ва>л! !1, то селективную метку вводят в разные концы с помощью (и-"Г(г1ЛТР или [сс-»Р(г10ТР: ПАТР 5сААТТСХХХХХХС>-3' — 3'-ААС Х ХХХЛ>ХСС ГА(3-5' 5'-ААТГСХХХЛХХО-3' 3'-СХХХХХ ХССТЛ ГяТР 5'-Ае>'(ТСЛХХХХХ(3Гх 3' — 3'-С>ХХХХХХСС ГАС-5' Используя кленовский фрагмент, радиоактивную метку можно вводить н в рсстрикты с ровными концами. В этом случае используется свойство полимеразы опцеплять 3'-концевой нуклеотпд и подставлять из реакционной среды новый, если он присутствует в избытке: 5'-ХХХХХХХЛГГЛС>-3' -„, 5'-ХХХХХХХХТАС-3' 3'-ХМчХХХХХАТС-5' — 3'-ХХХХЛХХХАТС-5' Кленовский фрагмент ДНК-нолимсразы 1 применяют также для синтеза второй н>зти кДНК (см.
с. 182)„для определения последовательности нуклсотилов в ДН К по методу Сан гера (см. гл. 9), для сайт-спсцифическо>о мугагенсза ДНК с использованием синтетических олигонуклеотидов (см. гл. 8). Скорость работы этого фермента гл гйга при оптимальных условиях — около 30 нуклсотидов в секунду. Глава 6. Ферменты генанннеенон ннззееззеоизз !79 ДИК-иолимераза фага 74.
Зтот фермент обладает теми жс активностями, что и кленовский фрагмент ДНК-полимеразы й Однако 3'-+5' экзонуклеазная активность ДНК-полимсразы фага Т4 существенно более эффективна, особенно на однонитсвой ДНК, поэтому для введения метки в рестрикты с 3'-высзупаюьцими (и, конечно, ровными) концами лучше использовать эту полимсразу. Метод основан на том, что после деградации однонитевоз о участка фермент в присутствии определенного нуклеотида отщепляет мономерные звенья с 3'-концов фрагментов до тех пор, пока в двунитевой ДНК не встретится одноименный нуклеотилный остаток.
После этого он замещается аналогичным нуклеогидом, присутствующим в среде. В результате образуются либо ровные концы 5'-ХзХХХХСОТАСзСТОСА-3' з ззрзсзСГР 5'-ХХХХХСОТАСзС-3' 3'-ХХХХХОСАТСО-5' — — — з 3'-ХХХХХОСАТСО-5', либо 5'-выступающие 5'-ХХХХХСОТАОСТОСЛ-3' ~ ззр)ЛТр 5сХХХХХСОТ-3' 3'-ннннясезтее-5' 3'-нюзннеелзео-з.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
