Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Данный фермент используют ддя удаления л1г~бых однонитевых струк1ур, включая бреши (однонитевые участки в Лвунитевой молекуле ДНК), концы шпилек и частично денатурированные области ДНК. Он может образовывать ники в суперскрученных молекулах ДНК, атакуя *'расплавленные'" АТ-богатые участки. Следует учитывать, что фермент может расьнешитьдвунитевую ДНК напротив ника. С его помощькз осуществляют картирование транскрибируемых областей гецомов, обрабатывая ферментом дуплексы ДНК:мРН К 131-шарр)пя). 184 '!асть КС Галлая ил>хе»ерин и> Ыао ХХутиеаза ит прорвстков згьл>тистол !!>асгьгл (>ттлщ Ьеап).
Ферме> и по своим свойс гввм похож на 81 нуклеазу с тем положительным отл>шием, что он не расщепляет ДНК ни ~ротик ника. УХуклеаза2)а237. Фермент выявляют из псевломонады А!!его>лолах е>релали Ва)31. Он обладает энлонуклеазной активностью !Епй>) по отношению к однонитсвой ДНК, а также 3'- экзонуклеаз~ юй активностью на лвунитевой ДНК, благодаря чему катализнруе.г отщепление небольших олиго- или мононуклеотилов с обоих концов молекул. Субстрат для экзонуклеазной активности фермента лвунптевые фрагменты ДНК как с ровными, так и с выступающими концами.
Изменением условий можно по пи урав~~я>вскорости гидролиза обеих нитей с обоих концов ДНК, так по орели укороченных продуктов реакции 80 — 90 % составляют фрагменты с короткими 5'-выступающими концами !около пяти нуклеозидных остатков) и 10 — 20 о фьрагментов с ровными концами: Ехо 3'-%ЧАЧИ)>11>!... МЧ 1'41>1М'4!>!-5' — > Ехо 5 )'1)'11'!>ч)ч)>11'1- )>!1>1Н 3 Епг)о 3'- И!ч Х... М'~ ММ>! М>! -5' Епг1о 5'-Х !> ХХММЧ )>1 М)>1-3' „5'-Х)>!ИХ МЧ ХМ ЛЧ-3' — - > 3'-Хг>)>! !ч М!ч ! 1)>11>11х1-5' 3'-ХХ !чу!>! Х ММ)х)1>1-5' Это позволяет применять ланную нуклеазу лля укорочения лвунитевых фрагментов ДНК на заданную величину и для картирования сайтов рестрикции (см.
гл. 8). Активность фермегпа ре> улируется изменением температуры и концентрации ХаС! и полностью зависит от присутствия кальция, поэте>му останавливают действие фермента добавлением ЭДТЛ. Нуклеаза способна лелать ник в лвунитевой молекуле ДНК против ника, имекнцегося и комплементарной > ~ити. Зкзонуклеаза Лl Г. сг>!!. Фермент катализирует послеяовательное ула.~ение 5'р-мононуклеотидов с 3'ОН-коннов лвунитевых ДНК. В сонета> ~ии с нуклеазой 81 он применяется для укорочения фрагментов ДНК: 5-ЬПЧН)х!М ЪМ П) 1-3 КН 5-М П)Ч)х!М )ч'-3' 3'-~41>1МЧМ~Х!ч)чХ-5' — -> 3'-Ь)>)МНМ~Н-5' — > 5'-ХМ~ Х-3' — > 3'-М'~Г4Х-5', Глава Г>.
Ч>ерл>е>з>ии> геиетииескии иизкекерии 185 а в сочетании с ДН К-полимеразой его используют лля введения в ДНК радиоактивной четки. Фермент удаляет нуклеотиды с 3'ОН-концов лаже в пиках, образуя при зточ бреши, но не гилролпзует одноцитевую ДНК и 3'-выступающие концы, содержащие, как минимуч, четыре нуклеотила. Зкзонуклеаза Ш обладает также 3'-г)>ос4>атаз»ой активностью ца одно- или лвунитевых ДНК, имеющих 3'р-концы, и катализирует реакцию 3 р-+3 ОН. Кроме то> о, па луплексах ДНК Р)1К она действует как рибонуклеаза Н (см. ниже). Экзо>зрклеаза фага Е Ферме>гг кгакует преимущественно лвунитевую Д11К и отшепляет 5'-пуклеозилмо> к>фосфаты от 5'-концов цепи.
Его использу>от для получения однонитевых выступающих 3'ОН-концов, послеловательно удаляя нуклеотиднь>е остатки с 5'р-концов комплементар»ых нитеи: 5'-ХХХХХХХХХХ-3' 5'-ХХХХХХХ-3' 3'-ХХХХХХХХХХ-5' ---- — 3'-ХХХХХХХ-5' Дезокеарабоауклеаза з (г>анкреаз ическая ДН Каза). Фермент облалает знлонуклеазной активностью по отношению к о>пю- и лвунитевой ДНК. Зто позволяет с его помощью гилролизовать ло моно- и олип>нуклсогцлов любые препараты ДН К. В присутствии ионов магния ДНКаза атакует каждую пить ДНК независимо, позтому разрывы ковалентных связей распределяются по нитям случай»ым образом.
В присугсз.вии ионов марганца фермент расщепляет обе нити ДНК приблизительно в олпом сайте, что приволит к образованию фрагментов ДНК, у которых концы нитей ровные нли выступах>щие ца один — лва нуклеотила. Рабоиуклеаза зз'. Этот Фермент, вьщеляемый из клеток Е. со!>', является энлорибонуклеазой, расщепляющей РНК в луплексах ДНК;РНК. В результате образуются олнонитевая ДНК и олигорибонуклео>илы.
Двунитевые ДН К и )'Н К он не гилролизует. Другие Ферменты Терл>анель>зая дезокеаззуклеотидилгарааефераза. Терминальная трансфераза )лобывается из тимуса зеленка) способна наращивать на концах Фрагментов ДНК однонитевые участки пугем послеловательного присоединения к 3'ОН-концам обеих нитей нуклеотилных осгатков из тех лезоксинуклеозилтрифосфатов, которые 13б с1асть 11. Генная нтженернл т и!гн добавлял>тся в реакционную смесь.
Наиболее эффективно терминальная трансфераза удлиняет выступающие олнонитевые УОН- концы, сформировавшиеся, например, при лействии соответствующих рестриктаз или после прелваритель1юй обработки ДНК экзонуклеазой фага ).. Однако наращивание однопитевь1х У-концов возможно и на фрагментах ДН К с ровными копнами и даже с олнонитевыми 5'-концами. Для этого создают условия, дестабилизирующие вторичнук~ структуру ДНК (низкая ионная сила, замена ионов Мйн на Со" ), гго способствует расплете~1ию нитей на концах фрагментов и действюо фермента. Таким образом, реакция протекает даже на фрагментах, образованных физическими метолами дробления ДН К. Терминальную трансферазу используют для создания на соелпняемых фрагментах ДНК искусственных липких концов, например, олиго(ВЛ) и олиго(гГ1).
Этнг фермент способен синтезировать гомополимеры длиной до нескольких сотен нуклеотильп 1х остатков. Однако для эффективного объединения фрагментов к каждому из их концов добавляют не более 10 — 40 осгатков. Длина образующихся па концах фрагментов ДНК гомополимеров контролируется изменением условий реакции. Субстратом лля терминальной трансферазы являются также олнонитевые разрывы в ДНК. 1!оэтому препараты ее не должны солержать эндонуклеазы. мелочные фоефитазы.
Фосфатазы облалают широкой специфичностью: опи гилролизуюг самые разли шые эфиры фосфорной кислоты. В генети <еской инженерии используют щело 1- ную фосфатазу из клеток Е сод и из кишечника теленка; первая термостабилы~а, а вторая инактивируется при 63 С. Эти ферме~и ты применяют для лефосфорилирования одно- и лвунитевых молекул ДНК или РНК на 5'р- и 3'р-концах.
В однонитевых разрывах ДНК или на концах фрагментов, где фосфатная 1.рупия (например, 5'р) маскируется олнонитевым 3'ОН-концом комплеме~ггарной цепи„реакция идет с трудом. Повышение, температуры реакционной срелы лестабилизирует лвунитевую структуру и устраняет отмеченный нелостаток. Болинуклеотидкииггзл фага Т4.
Фермент способен переносить у-фосфат с ЛТР на лефосфорилированные (обычно с помощью 1лава 6. Фермевглм гелеьчичеекоа анаеелерия 187 щелочной фосфатазы) 5'-концы. Это его свойство используют лля введения ралиоактивной метки в 5'-копим одно- или двунитевых молекул ДИК или РНК: 5'ОН-?4?4Н?4?4Р1-3' + 1у-цР1ЛТР— — + 5'р-ННР7НН?4-3? ь А!3Р. Если в среце присутствует избьпок Л1) Р. то в зтих условиях полинуклеотидкиназа способна замещать концевой 5'-фосфат на 7-сросфат АТР, при этом надобность в фосфатазе отпалает: 5'Р-1хП'4 Н7 Л'~-3' + 17-нР1ЛТР + А!3 Р— > — > 5'р-?4?4 г1?4 !х1-3' + ЛТР + ЛО Р. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 6.!. Рсстриктазы ВилЯН, Вх!Н, Вгй, Л7ю!! и Зан3А образуют прп гидролизс ДНК олинаковыс липкие копны, что позволяет лигпровать любые пары образов:щных ими рсстриктов. Какая лола образующихся гибрилных сайтов в каждом из вариантов может быть разрезана рестриктазой ВамН1, ре.
~риктазой Хйо!!? 6.2. Можно ли мщщть специфичность лействич рсарнктаз? 6.3. В каких случаях при лигпровании смеси всех ресгриктов, полученных действием олцой рестриктазы, улается восстанозиз ь исходную структуру ДНК? бгй Как вволнтся радиоактивная метка в 5'-консц фрагмента 2!НК, в 3"-конец? Рассмотрите реакции олнопитевой и лвуннтесчйДНК. Можно ли ввести метку только в один конец дуплекса? 6.5. Какова область применения ДНК-полнмеразы 1 и сс клсновского фрагмента? 6.6.
Как решается проблема синтеза полноразмернои кДНК? 6.7. Болыцинство рестрнктаз не расщепляют олнонитевую ДНК. Было найдено, что олна из них, тем не менее, ведет такую реакцию на опрелелснной ДНК. Чем зтот эффект может быть объяснен? 6.8. Некая плазмпла, выделенная из клеток Е. со!б содержит сайты действия рестриктазы Ибо!„но не расщепляется ею.
В чем может быть причина? 6.9. Почему рсакцщо лигированпя ведут при пониженных температурах? 6.10. Какие условия в эксперименте определяют вклкзчение полимсразпой или экзопуклеазной активностей ДНК-полпмераз? Хлава 7 ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В БАКТЕРИЯХ Вектором (от лат. гесюг -- переносчик, ~юситель) в генети ~еской инженерии называют молекулу ДНК, способную самостоятельно реплицироваться, включать чужДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабилглю там поддерживать. Векторы используют лля созлания (л ила молекул рекДНК и лля послелующего ввеления их в клетки, в результате чего индивидуальные молекулы из исходной смеси рекДНК разлеляюгся ~ю отдельным клонам и в составе послелних умножают (клонируют) число чужеродных генов.
В этом смысле любой вектор является клонирующим. Векторы также значительно облепщют процедуры по выделению клонированной ДНК из клеток. Поллежащнй переносу генетический материал вволится в состав вектора с помощью различных ферментов (ресгриктазы, ДНК-лигазы). Первые век горы были созданы для работы с клетками кишечной палочки (!..оЬЬап, Ка)вег, 1973; Со!~еп ег а!., 1973).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
