Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 38
Текст из файла (страница 38)
При этом комнлементационная активность а-пептидов сохраняется на прежнем уровне, так как слвига рамки считывания при трансляции нс происходит. Интеграция с!ужДН К в вектор через полилинкер вызывает инактивацию !х-пег!тила, что позволяет отбирать срели ампициллин-устойчивых трансформантов клоны с рекДНК по Гас фснотипу рсциписнтных клеток. Колонии таких клеток на плотных средах с хромогенным субстратом Х-8а! (5-бром-4-хз!ор-3-инлол-(з-ь)-галактозид) и индуктором!ас-оперона 1РТС (изопронил-)з-В-тиогалактозид) бесцветны, в то время как Гас' колонии окрашены в голубой цвет.
Близость лак гозного промотора к полилинксрам обеспечиваеч возможность экспрессии в векторах р()С генов, клонировацных с помощью различных рсстриктаз. а) 1аст' 6) !апре в) М11 1асг' ас! 1ас! осф-) ер) Асс! Зта! нысп г) №!201 Зсош Зас! Крп! Хспа1 Вивт!1 Хьа1 Зап РИ1 Зры Н1ылп . ===-а:. .МСЗ1З Е1202 !П21! асс! нысп Зтв1 л! 6120! Нтд!П Зрм Раа1 За11 Хьа1 Вапй!! Хтв1 Крп1 Зас1 Всоа! а!сз а —— №!202 №!21! Рис. 74.
Строение векторов р() С18/19 (а), М ! Зп!р!8/19 (б), р(УС! ! 8/119 (в) и их сайтов поликлонированиа МС818 (г) и МС819 (л). Праймеры (указаны по каталогу фирмы ")Че!я Е081апд В!о!аб") №120! и №1211 предназначень!лля секвенирования, праймер №!202— для синтеза гибридизапионных зондов 200 Часзь В. Генная иннненернн гн ьлхгн Система с гх-комнлсмснтацисй оказалась настолько удобной и эффективной, что стала применяться во многих других векторах — нлазмилных и фаговы. Была нредложсна и альтернат ивная системз, основанная на использовании генов (ихЛВ, колируюших люцсфсразу. Люцефсраза катализируст окисление восстановленной формы флавинмононуклеотида (ГМИН,) и алифатических альлегидов, имеющих длинную цепочку: ГМХНх + 1(СНО + О, — э ГМ)н! Ь ВСООН Ь 11,0 + свет.
Клетки Е. со(Г способны вести эту реакцию„если снабдить их люцсферазой и добавить в среду сост встствующий ал ьлегид (например, додскангпь). Гены !ихЛВ из Илю йекееу! были клонированы и экспрсссированы в Е. сой с помощью нлазмидного вектора. В ген!ихВ был вставлен полилинкср, не нарушающий синтез люцеферазы (Бст!дну, Ооьвагг), 1990). Интегрзция чуж)(НК в нолилинкср приводила к гашению биолюминссцснции„позволяя отбирать необходимые т ране<)юрманз ы. Прси му | цест во этой систслхы — возможность использовать любыс клегки Е. сой и лаже энтеробактсрии.
Игазмиг)а Р15А. Эта плазм ида, выделенная из штамма Е. сей ! 5, относится к Со! В1 — типу рснли конов, но совместима с друпгми илазмидами это~о типа. Это позволяс~ использовать ес для совместной трансформации с лруп жги плазмидами, на~ример, с ~ иазмндой рВВ322. Системы из лвух векторов улобны лля регуляции экспрессии клонируемого гена, носкольку позволяют расположить с|руктурный и регулирующий гены на разных нлазмидах (см.
~ л. 10). Сама нлазмила Р15Л кри~ цичсская, т. с. не придает клеткам какой-либо определяемый фенотин. Поэтому при конструировании векторов к ес репликатору нрисоеди шлот фрагмс~ и ы ДН К, солержащис селект иьч1ые маркеры. Так, вектор рЛС*т'С!77 состоит из рснликатора Р15Л, гена л)пк из транспозона Тп903 и ~сна Арн из транспозона Тп3 (рис. 7.5,а). Этот рс1шикатор имеется и в векторе рОК12, который по структуре сходен с вскгорами тгпта рНС, но солержит маркер Кхлн(Х5е!га, Мсзз!ля, 1991).
йектпри прямой селекции. '1акис векторы содержа~ ген (или сайт), продукт которого (или сама нослеловательность) в определенных условиях является "ядом" для клеток. Мишенью может быть ген-ренрсссор, контролирующий ген антибиотикоустойчивости или цитотоксичсские гены (например„Ы, ссг0, находящиеся цод серо~ им контролем. Инактивация подобных генов внедрением в Глава 7. ))еко!орс! дна коонироеоньа о бактерсеах 20! них чужД11К поз1золяет трансформантам выжить в этих условиях. Основное затруднение при работе с такими векторами связано с необходимостью использовать специальные пгтаммы бактерий или срелы.
Другой нелостаток этих векторов — невозможносп во многих случаях использования полилинкеров, так как их ввелсние обычно ипактивируст ген. 1 1аиболее практичен вектор рЬХ100, солсржаший ген ксилозоизомеразы ху)А под когпролем лактозного промотора. Высокий уровень концентрации этого фермента не позволяет клеткам Е, соВ расти па минимальных средах с ксилозой. Внелрение чужДНК в ген ху)А через елиничные сайты ВагпН1, Ипг(111, Р811 или Л7701 инактивирует этот ген и с!юсобствует выживанию только трансформантов, имевших рекомбинантную плазмилу (В!ечз, Но, 1987). мсз 1 2 6) РР6 Ф~ ~8Р6Ф,! 'и!пап! Бсоа! Ара ,'Ара РАСЪ'С!77 ! РГ!БМ772 ; (2940 .) .
(2.87тп,п,), Асс! А"1 сн ) ° '"" 1 нысп в и! 11 зспз сс! ', пасси! !Впав ; Асаг Асс! ~ Зспа! Яаи ~ Вас! Раа! ~асов! г!са)!1! ,Т71 'Т7'!'; Рис. 7тх С!роение векторов рАСУС!77 (а) н РОЕМ! и рОЕМ2 (6). Стрелки е МСВ указыва!о ! на паправлспие транскрипции с фа! овых промоторов ВРб и Т7. Указаны только едино! венпыс саят.ы рестрикции Н)псн Ран . вви а) Н1па1ПБссЬЛ зтпаГ нпл ХЬс1 ВекаторырбаЕМ. Описанные плазмидные векторы пригодны лишь для клонирования генов в клетках Е, сой и ролственных им !рамотрицагельных бактерий, например, ВойоопеИа и Зеггаг(а.
Они универсальны — их используют для самых разнообразных целей. В то же время сконструировано много специальных векторов, приспособленнь!х, например, только лля идентификации ре!уляторных си~палов, для суперпродукции чужеродных белков и их секреции, лля секвенирования ДНК, экспрессии генов животных в 202 с1аогь 1!. Генная ннжснсоин зп нтсо бактериях и т. д. Некоторые из них описаны в последукяцих главах. Здесь же еще раз отметим особенность современных векторов, преллагаемых фирмами. Они„во-первых, содержи полилинкеры, причем для удобства пользования их внедряют в противоположных направлениях.
Таким образом, векторы выпускаются парными, что отражается в порядковом номере ири их названии. Вовторых, у векторов иа концах полилинкеров находятся промоторы фатов Я'6, ТЗ и/или Т7. Это позволяет осуществлять транскрипцию клоиировашюго гена )п итго в обоих направлениях с целью использования транскриптов в качестве ~ ибридизациоииых зондов или для транслирования в белок-синтезирующей системе. Примером могут ел>жить векторы рОВМ1 и рОВМ2 !фирма нПромега", рис. 7.5,б). Транеформацвя клетокЕ. соИ. Плазмидные векторы и рекДНК, сконструированные на их основе, вводят в реципиеитные клетки методом генетической трансформации, т. е. путем обработки клеток изолированной ДН К. Возможность трансформации бактерий зависит от их компетентности, т.
е от способности пропускать ДНК через клеточнук~ стенку. Для некоторых родов бактерий (Вас!1)их, Наеторйт1из, Рхсиг)отопах, Яггсргососсих, Ягсрготусех и др.) состояние компетентности естественно. В большинстве же случаев его приходится вызьилать искусственно. ! 1аиболее распространены обработка клеток двухвалентными катионами "на хололун и злектроиорация (пробой клеточной стенки электрическим током). Известно также, что последовательные циклы замораживания и оттаивания ослабляют клеточную стенку и делают ее проницаемой для вхождения ДНК в клетку. Отметим для полноты картины, что трансфорлизровать можно и бактериальиые протоиласты или сфероиласты, добавляя к ним в присутствии полпзтилеигликоля изолированную ДН К или ДНК, включенную в искусственные л~ембраиы — липосомы. Траисфорлшцикз клеток Е. сей илазмидами можно вести лкм бым из вышеперечисленных методов, ио наиболее распространен благодаря своей простоте так называемый качьпиевый метод.
Ои основан на обнаруженном Манлелем и Хига (Маис)е), Н!яа, 1970) факте, что клетки, выдержанные на холоду, в присутствии хлористого кальция становятся компетентными для их тоансфопмации Глава 7. Векторы д»я «яояироеа«ия е бо«>верил«203 (трансфекции) изолированной Д11К фага ).. Это наблюление оказалось справедливым и лля плазмил (Со!>еп е~ а1., 1972), причем эффективность трансформации достигает 1О' трансформантов на 1 мкг ДНК рВКЗ22. В типичных экспериментах клетки, выращенные до логарифмической Фазы роста, концентрируют ло плотности 10" клеток в мл в холодном 50 мМ рас.гворе СаС1, и помещают на лед на 30 минут. К ю|еткам, которые становятся компетентными в результате этих процедур, добавляют плазмидную ДНК, выдерживают их на льду еще 30 минут, поцвергак>т тепловому шоку при 42 'С в течение двух минут и затем высевают на чашки с селективной средой.
Перед последним этапом клетки обычно инкубирукп 30 — 60 минут в питательной несслективной среле, чтобы позволить селективному маркеру проявиться Фснотипически. Эффектиш >ость трансформации зависит и от бактериального штамма, и от структуры трансформирующей ДНК. Двунитевыс и од>юнитевые кольцевые молекулы, а также линейные молекулы с концевыми шпильками, замыкаквцими ковалентно обе нити ДНК, хорошо трансформируют клетки, в то время как линейные молекулы ДНК с открытыми концами велуг трансформапию на лва-три порядка хуже. Это вызвано тем, что такие молекулы гилролизуются в клетках Е.
со(1 экзонуклеазой Ъ', копируемой генами гесВСГ). Псотому в подобных случаях репипиентные клетки должны быть мутантными по этим генам. При этом„конечно„они теряют способность к голвцюгической рекомбинации. Для ее восстановления, ко>ла это необхолимо (например, если трансформация велется бактериальной ДНК), в клетки дополнительно вводят мутации «ЬсА или хЬсВ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
