Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Полимеразную активность фермента используют лля введения концевой метки в ДНК, имсзогцую 5'-выступакзщие козщы: 5'-ХХХХХСзС-3' [~ ззр)г)ХГР 5'-ХХХХХСзСГГАА-3' 3'-ХХХХХСОАМТ-5' — — — — з 3'-ХХХХХСОААТТ-5'. С помощью ДНК-полимеразы фага Т4 можно вводить метку и в обширные области двунитсвых фрагментов ДНК, используя последовательно се экзонуклеазную и полимеразную активности: 5'-ХХХХХХХХХХХХ-3' Е 5'-ХХХХзХХХХ-3' 3'-ХзХХзХзХХХХХХХХ-5' ----> 3'-ХХХХХХХХ-5' — — ' — э 5'-ХХХХХХХХХХХХ-3' о 3'-ХзХХХХХХХХХХХ-5'. Зкзонуклеазная активность проявляется при отсутствии в среде пуклсотидов.
Полимеразную реакцию инициируют добавляя в срелу меченые йМТР. ДУХК-иолимераза фага Т7. Фермент обладает 5'-з3'-полимеразной и 3' — з5'-экзонуклеазной активностями. Он состоит из двух субъединиц: продукта гена 5 фага Т7 и вспомогательного белка тиорсдокснна Е.
соЬ' Последний повышает спабильность комплекса 130 Часгь 11. Гелнае алекеаерая гл Ыаа фсрмснт-матрица и увеличивает процсссивцость полимсразы погти в 1000 раз (ло 2000 — 3000 пуклсотилов). благодаря этому фсрмеьп удобен лля копирования еггноситсльно длипных матриц. Для ссквспирования ДН К по методу Сэнгсра (см. гл. 9) используют химическую или гсгшо-инжснсрную модиФикации полимсразы, в которых экзонуклсазпая активность подавлена. Эти мопификации получили назван ив ссквспаз. Опи эффективно включают в ДНК лилсзоксинуклсотилтрифосфаты и аналоги нуклсотилов.
Скорость их работы Гл г!гга при оптимальных условиях — около 320 нуклсот илов в сскучшу. 7ау-палгьиераза, Фср мент получьчот из тср миф илы ~ ы х бактсрий 7леплем ае)ил!!саги поэтому оп сам тсрмостабилсп: рсплицируст Д11К при 74 С и сохраняет половину своей функциональпой активпости г|ослс г1ро~ рсва при 95 С в тсчсиис олиоео часа. Пропсссивность полимсразы прсвышаст 7600 нуклсотидов, благодаря чему она использустся так жс, как ссквсназа. Фермент облаласт 5' — >!'-экзонуклсазной активпост ью, но рслакторская Зс-ч5' экзоцуклсазная активность у него отсутствует. Это приволит к появлению ошибочных нклктчсний !л 19!го с частотой 10". ДттК-полимеризы )епг и,Оеср )впг происхолят, соответственны по, из ба к гери и 7леггяае осла !!гага!м и Рупнисах лрееуех О)3-13, найденных в глубоковолных термальных источниках (тсгц — выход, отверстие).
1'сны этих полимсраз были клонированы, и фсрмснты вылсляют из скопструированных для этой цели продуцснтов. Полимсразы высоко тсрмостабильны: они сохраняют половину своей функционалыеой активности после прогрева при 95 С в тсчснис 7 (Усп1) и 23 (ОссрУсп1) часов. Ферменты облаивают 3' — >5' экзоцуклсазпой активностью, поэзому точность спнтсза повышепа на порялок по сравнению с Тай-полимсразой. Однако из-за этой активности они мокн ут укорачивать праймсры, поэтому для синтсза относительно коротких Фрагментов ДНК (напримср, при ссквснировапии) используют полимсразы с инактивированной экзонуклсазной активностью. РЛК-зависиман ДЛК-палимераза.
биологическая роль этой полимсразы заключастся в образовании ДНК-копий гсномов некоторых РН К-солсржап1их вирусов, поэтому сс называют еще образ пой трапскриптазой. Обычпо используют фсрмснт, кодирус- ! лава 6. Фегрх!енм!и генеепинеский ин,женерии 18 ! мый вирусом миелобластоза птиц. Он состоит из двух полипептидн ых цепей, олна из которых несет экзорибонуклеазную и 5'-+3' полимеразну!о активность.
Экзорибонуклеазная активность проявляется только на дуплексах Д))К:РНК, причем цепь РНК гилролизуется путем гюследовательного отщепления нуклеотидов с обоих концов цепи. Как полимераза фермент работает на олнонитевых молекулах РНК или ДНК, образуя комплементарные лезоксирибонуклеотидные цепи (кДНК), для чего ему требуются праймеры с 3'ОН-концом. Скорость работы зпзго фермента гл и!!го при оптимальных условиях низка, всего 5 нуклеотидов в секунду. Получение л! ! !гго копии структурной части гена с какой-либо мРНК велуг в лве стадии: синтезируют сначю|а однонитевую, а затем двунитевую кДНК. Па первой стадии в качестве праймера испсшьзуют обьзчно грлигонуклеотид (с)! ) и который гибрилизуется с полпадениловой цепочкой на !'-конце л!РНК !рис.
6. !). Олигонуклеотил должен состоять, по крайней мере, из ! 2 звеньев, ч тобы обеспечить стабильность дуплекса в условиях реакции !трио-буфер, рН 8 3, 46'С). Выход олнонитевой КДНКсоставляетли!пь 5 -20% от числа молекул мРНК, причем получить копию с мР! )К, длина которой превышает несколько тысяч пар нуклеотилов, крайне 3 рудно. Для полу !ения длинных цепей кДНК требуются 30-60-кратный молярный избыток фермента по отношению к матрице, а также высокие концентрации сПхгг"Р (до ! мМ). 5' хллллл-з ° рнк 3'-ТТ'! Г!' !с5' Прайпср Обрааиав Пппсирип~ааа лллллл-з' рнк ! '!'Т'! Т'!.5' в/ШК !ониоииасваа) Оврааиаа сраисвриспаы дгГК-попиа1срааа т т '!' т -5' лллл-з !!укасам а1 3 тттт-5' вдНК !двуаитсваа! 5' - ллЛл-3' Рис.
гх!. Схема си!!таза кДНК с помощью обратной транскрлптазы 182 Часть 11. Геллая ияахелерия и игто Во многих случаях по неясным причинам в конце первой сталин обратная транскрнптаза копирует. часть только по синтезированной пити кДНК. Это приводит к образованию однопитевой петли, 3'011-конец которой служит обычно праймером для синтеза второй нити кДНК (Н18ос1й ег а!., 1976). Предварительно щелочью или рибонуклеазой Н (сьь с.
185) гидролизуют мРНК, а затем велуг полимеризацию обратной транскриптазой, кленовским фрагме1 пом ДН К- полимеразы ! и ДНК-полимеразой фага Т4, по отлельности или в любой комбинации, что зависит гп нуклеотидного состава матрицы. Эти полимеразы при синтезе вторьгх нитей кДНК останавливаются в раз~ ~ых участках (эффект "паузирования" полимераз), так что их совместное применение позволяет увеличить ллины синтезируемых нитей, На заключительном этапе с помощью нуклеазы 81 (см. с. 183) гилролизуют концевые петли и пол)"гают лвунитевые кДНК. Их выход достигает 30 — 100% от числа однонитевых кДНК.
Конечно, из-за действия нуклеазы Я! теряется информация о строении 5'-конца мРНК. Способы сохранения этой информации описаны в гл. 9 (см. рис. 9.3). Некоторые РПК (рибосомные или вирусные) не имеют на своих 3'-концах полиадениловых цепочек. Такие цепочки можно образовать, добавив к препаратам РНК поли(А)-полимеразу Е. свй (см. с. 183), С помощью обратной транскриптазгя можно синтезировазл копию лк>бой части мРНК, выбрав лля этого полходяший праймер. Эта возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка гена.
Но можно получить и набор генных фрагментов, если использовать в качестве праймеров произвольные олигонуклеотиды, получаемые, например, в резулгяате гидро- лиза ДНК тимуса теленка панкреатической ДНКазой. Их разнообразие столь велико, что среди них имеются комплемензарные послеловательпости к любому из участков мРНК (или ДНК).
Добавление в реакционную смесь суммарной фракции таких праймеров лает возможность получить в наборе к7(НК копии всех участков анализируемого гена. Они полезны лля использования их в качестве гибридизационных зондов, применяемых для поиска определенных клонов в банках генов (см. пь 9). 1 лава 6. гйерменмн геиеглиеегкоа ивиеенерии 183 Пола(Л)-поламераза. Фермент, выделенный из кзеток Е.
ео)0 образует на 3'ОН-конце лк1бых однонитевых молекул РНК полиадениловые цепочки длиной до нескольких тысяч звеньев: 5'-)ЧМЬПМХЬ)Х)Ч-3'ОН + ИГР— > — г 5'-ХЫг)г11~1ЫХГ4(Л„)-3'ОН + пРР1. Он также способен добавлять к РНК полицгпидилонь1е и полиуридиловые цепочки, но с гораздо меньшей эффекгивносгью.
Полимеразу использукл для подготовки РНК в качестве матрицы при синтезе кДНК, а также для введения в РНК 3'-концевой метки. РНК-поламеразы 4агов 7э, Т7 и ЯРб. РНК-полимеразы фагов ТЗ и Т7 Е. со!1 и ЛРб Х 0р/вашпигл высокоспецифичны к промоторам собственных фатов. На фоне многих других промоторов на молекуз1ах ДНК они узнают только "свои" и синтезируют только определенные молекулы мРНК. Это их свойство используют лля приготовления меченых гибридизапионных зонлов и полноразмерных транскриптов для синтеза белков и илга.
Полимеразы обладают высокой пропессивносгью: выход продукта рл игго в оптимальных услониях составляет более 100 молекул мРНК на одну молекулу ДНК. Пук зеазы Пуклеша Я1. Жсп фермент„выделяемый из гриба Агрос))вг огугде, облалает эпдо- и экзонуклеазной акгивностями и не проянляет какой-либо специфичности к нуклеотилной последонательности ДНК. При концентрации НаС1 около 0,3 й) нуклеаза $1 гидролизует только олнонитевые полинуклеотиды (ДНК в пять раз быстрее, чем РНК), а в двунитевых не образует лаже ники.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
