Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 32
Текст из файла (страница 32)
В результате у фрагментов ДН К образуются, соответственно, выступающис однонитсвые или ровные (тупые) концы. Конечно, в местах разрезов (1,Т) выступающие последовательности нуклеотидов, относящиеся к разным нитям ДН К„являются комплементарными (липкими). В случае действия рестрикгаз подкласса 11Р, узнающих палиндромпыс сайты„все рестрикты обладают липкими концами. Пример мого типа рестриктаз — эндонуклеаза ЕсоК!„ образующая 5'-высгупаюшие концы: 5'-Ь-)Ч-Х-СЙА-А-Т-Т-С-Х-М-)Ч-3' 3'-)Ч-)Ч-М-С-Т-Т-А-АТП-~Ч-1М-Х-5' — -> 5'-)ЧИХА-3' + 5'-ААТРСМММ-3' — > 3'-ХХХСТТАА-5' 3'-С)ЧХ)Ч-5' Выступать могут и 3'-концы как, например, при действии рсстриктазы РН: 5'-М-М-М-С-Т-0-С-АЮ-Х-М-1ч-3' 3'-1Ч-М-)Ч-СЛА-С-О-Т-С-М-М-Х-5' э , 1'Ы 5'-ММ~1СТПСА-3' 5'-СХХ)Ч-3' — + 3'-М4МО-5' + 3'-АСОТСХ)ч" Х-5' Глава б.
Ферменты генетическии ингкенерии 1бт Пример действия рестриктаз второго типа; 5'-1'й-Х-Х-С-С-СЫ-О-О-Х-Х-Х-3' 3'-1ч'-Х-М-О-О-ОТС-С-С-Х-Х-Х-5' — — т 5'-11Х)х1ССС-3' + 5'-СОМ 1ХХ-3' — + 3'-ХХ1 1ООО-5' 3'-СССМХХ-5' В приведенных примерах сайты расщепления совпадают с сайтами узнавания. Такие сайты называют еще сайтами рестрикции.
Когда они представлены палиндромами, то на разных нитях ДНК гидролизуются связи, расположенные либо симметрично относительно центра палиндрома, либо в самом центре. Это позволяет предыдущие примеры записать в краткой форме: 5'-О1ААТТС-3', 5'-СТОСАЮ-3' и 5'-СССР.ООО-З', причем знаки 5' и 3' могут опускаться. Знак "~." указывает на положение 1тщролизуемых связей, которое определяет число нуклеотидных звеньев в выступающих концах. Примеры возможных вариантов строения концов у фрагментов рестрицированной ДН К представлены в табл. б.1. Для рестриктаз, узнающих непалиндромные последовательности нуклеотидов и расщепляющих ДНК в стороне от сайтов узнавания, в кратких записях указывают в скобках для каждой нити расстояния от них до гидролизуемых связей.
Например, ресгриктазу Нба1 характеризует запись ОАСОС15/10). Она расшифровывается следующим образом: 5'-ХМОАСОСММХ1Ч)ч йМ1ЧМ~ПМХМ-3' 3'-ММСТОСО1ЧХМХХХХММЧЗ ХМ-5' — + 5'-ХМОАСОСХЬПхП~ПМ-3' — э 3'-111 1СТОСОХХХХММХХМ~1-5' Многие рестриктазы, даже выделенные из бактерий, относящихся к разным семействам, узнают на ДНК одинаковые сайты. Такие рестриктазы называют изомерами. Они подразделяются на изошизомеры и гетерошизомеры. Первые не толька узнают одинаковые сайты, но и одинаково их расщепляют, а вторые эти сайты расщепляют по-разному. Примеры изошизомеров представлены в табл.
6.1. Гетерошизомерами являются, например, рестриктазы Азр7181 (5'-О иОТАСС-3') и Крп1 (5'-ООТАС1С-3'). Некоторые рестриктазы характеризуются большим числом изомеров. 168 Часть П. Гениоя иижеиерие т игсо Так, для ВаглН! найдено 20 изомеров, из них четыре изошизомера; у Рхг! описано 42 изомера, из ннх девять изошнзомеров и т. д. Таблица бд Структура каинов ДНК, образуиядихся нри действии рестриктаз в пределах сайгон узнавания Сайты навал ия Выступаю- Число щий конец звеньев Рсстрнктазы п=4 (бАТС СЗ.Сб бб.ьСС ВлиС1, 3/оо1, ВаиЗА! НарП, НраП, Мло! ВзрК1, ВеиК1, СВ1, Б и!31, НаеП1, Жа! Ноа1, Бш!3П1 ИаП! 5' 5' Пст 3' 3' ЕСОКП Ахи!, Баи96! Ару1, Аог!, Вел!, Тая)(! Всн! 5' 3' 5' 5' Нет 3' Рестрикты, имеющие одинаковые липкие концы благодаря действию одной и той же рестриктазы или ее изощизомеров, способны обьединяться друг с другом с восстановлением сайта рестрикции между ними.
Но одинаковые липкие концы могут образоваться при действии на ДНК рестриктаз, узнающих различные сайты. К таким ферментам относятся, например, рестриктазы ВаглН1 (5'-И.ЯАхТСС-З'), ВяЛ1 (5'-А1.бАТСТ-3') ИлВП1, Няи( Нс(е! Нра1, Но~сП, Иекй! Васи, 5ип Рег1, Юа/Р1, В/Л Примечание: и— знаком "('" отмечено нухлеотндов указана в ббб 1С САТб1 п=5 АСС(А/Т)бб б.(б!ЧСС С С 1(А/Г) б б СС(С/б).ьбб и=6 А1АбСТТ СА1ТАТб СТТ.(ААС ССбС(бб СТбСА1б число пар нухлсотндов в сайте узнавания; место расщепления ДНК.
Последовательность направлении 5'-+3'. Глава б. Ферменты генетической инженерии 169 ВсЛ (5'-ТЫЛТСА-3'), ХЬо!1 (5'-РЫОКК".Ру-3') и Ибо) (5'-.(ОЬТС-3'). Нуклсотидные остатки, образующие липкие концы, здесь подчеркнуты. Конечно, в данном случае объединяться будут любые рестрикты, но восстановленные между ними сайты будут узнаваться только рестриктазой л)оо! или ее изошизомером Заи3А. Рестриктазы класса 111 сходны с рестриктазами класса 1 в том, что они действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов.
Комплекс состоит из двух субъединиц. Способность к специфическому связыванию с ДНК присуща только метилазе, поэтому ее называют ЫЬ-субъединицей. Расщепление ДНК К-субъединицами происходит на определенном расстоянии от сайтов узнавания. Например, рестриктаза ЕсоР! характеризуется сайтом ЛОЛСС(27/25). КМ-система класса 1ч' представленапокауникалы1ым ферментом Есо571, в одной полипептидной цепочке которого имеются обе активности — эндонуклеазная и метилазная.
Фермент характеризуется сайтом СТОААО(16/14) (Регшзуге ег а1., 1988). Как и все ДНКазы, рестрикгазы активны только в присутствии ионов магния. Для действия каждой из них подобраны оптимальные условия. Главные условия — определенные температура и состав буфера. Однако с целью удобства в работе (но за счет падения активности ферментов в два-три раза) состав буфера для большинства рестриктаз удалось унифицировать (10 мМ Т1тз-ИС! рН 7.5, 10 мМ М8С1, и 1 мМ дитиотрейтол), оставив переменной величиной только ионную силу (концентрацию ионов натрия) реакционной смеси.
По этому параметру ферменты разделены на четыре группы: работающие при низкой (О мМ !ч!аС1), средней (50 мМ )ч!аС1) и при высокой (100 или 150 мМ )ч!аС1) ионной силе. Многие из рестриктаз способны работать в средах с разной ионной силой (табл. 6.2). Зги свойства ферментов необходимо учитывать прп планировании экспериментов по расщеплению ДНК одновременно (или последовательно) несколькими рестриктазами.
Оптимальная температура действия для большинства рестриктаз— 37 'С. Но, например, Зла! "предпочитает" 25 'С, а рестриктазы, выделенные из термофильных бактерий (ВзгВ1, Тол! и др.), эффективны при 65 'С. Последние при 37 С сохраняют только около 10 % своей активности. 170 Часть 11. Генная онжеяерия )п е11ео Таблица 6.2 Зависимость активности некоторых рестриктаз от концентрации (мМ) )ЧаС! (по данным фирмы Рпввеаа) Примечание: (++), (+) и ( — ) означают сохранение соответственно 50, 10 — 50 и менее 1О % от максимальной активности фермента; (а) — необходимо добавить минимум 15 мМ КС1 и инкубировать при 25 — 30 С; (б) — ннкубировать при б5 — б7 С. Типичный ферментатнвный гидролнз ДНК ведут в объелзе 20 мкл, используя 0,1 — 1 мкг ДНК и 1 ед.
фермента (количе- Глава Ь. Фермеяглы генетичегкоп июкелераи 17! ство рестриктазы, необходимое ~щя полного расщепления 1 мкг ДНК фага ), за 1 ч при рекомендуемых условиях). Когда расщепление ДНК ведут двумя или большим количеством рестриктаз, то их добавляют одновременно при условии, если они работают в одинаковых буферах. В противном случае первым используют фермент, требующий меньшей ионной силы. По истечении заданного времени его действия ионную силу среды повышают и добавляют второй фермент.
При необходимости реакцию останавливают добавлением 0,5 М ЭДТА (рН 75) до конечной концентрации 10 мМ. Некоторые рестриктазы при изменении условий гидролиза (неоптнмальный рН, пониженная ионная сила, повышенная на порядок концентрация фермента, присутствие органических растворителей, замена ионов магния на ионы других двухвалентных металлов) меняют свою специфичносты Например, при сдвиге рН с 7.5 до 8.3 или при отсутствии МаС!, или при замене Мй" на Мп"', или в присутствии 12 — 20 % глицерина эндонуклеаза Есой( перестает узнавать нуклеотиды, фланкирующие сайт узнавания, и работает как эндонуклеаза ЕсоК1* на сайте 5'-1ч,(ААТП'~-3'.
На изменение специфичности указывает знак (*). Отметим и другие осложнения, встречающиеся при работе с рестриктазами. Многие из них действуют на специфичные для них сайты, расположенные в разном нуклеотидном окружении, с различными скоростями. Так, Есор)-саи!т, расположенный на правом конце ), ДНК, расщепляется в 10 раз медленн~ж, а находящийся там же ЯасП-сайт — в 50 раз быстрее, чем остальные сайты.
Это обстотггельство может привести к ошибке в определении числа сайтов рестрикции в данном фрагменте ДНК. Найдено также, что супсрскрученные молекулы ДНК расщепляются медленнее, чем линейные. Ряд ферментов специфически расщепляют и однонитевые ДНК: Нйа1, Нтр! и Мл)1 с эффективностью 50 %, НаеП1 — 10 %, ЕЬлч1, 1)г(е1, НтЯ и Тая! — ! %. Рестриктазы А!и1, Юрл1, ЕоИ, Нра11, МЬо1, БииЗА и другие не обладают подобной активностью.
Метилазы. Следует различать сайт-специфические метилазы, сопряженные с рестриктазами, и мстилазы, используемые клетками про- и эукариот для различных регуляторных целей, Молекулярный механизм действия метилаз КМ-систем заюпочастся в переносе метильных групп с В-аденозил-1=метионина на определенные 122 Часп П, Генная инженерия Гл гйго остатки цитозина (образуется 5-метилцитозин) или аленина (образуется Гч„-лгетиладенигг), расположенные симметрично на каждой нити сагпуа узнавания, если сайты представлены палигщромалги. В результате одноименные рестриктазы перестают связываться с модифицированными сайтами и расщеплять их. Сайт узнавания устойчив к действию рестриктазы и в случае, если метилирована только одна нить ДНК.
Кстати, метилаза ЕсоР1, модифицирующая центральный аденин (АОАСС), вообще метилирует только одну нить. Изоцгизомеры не расщепляют модифицированные сайты, если сопряженные с ними метилазы метилируют основания, занимающие сходные положения. Примером служат изошизомеры ВатН! и Вяг(, у которых модифицированные основания (подчеркнуты) одинаковы: 5'-Г>ОАТСС-3' 3'-СС;ТАОО-5'. Наоборот, метилазы изошизомеров ЫраП и ЛГяр! модифицируют цитозины, находящиеся в разных положениях (5'-ССГ>Г>-3' и 5'-ССОО-3', соответственно), позчому эти рестриктазы расщепля- ют ДНК, обработанную метилазой изомера.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
