Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Стратегию конструирования фаговыхвекторовможно рассмотреть на примере создания первых векторов (! о~паз ег а!., 1974), предназначенных лля работы с рестриктазой Есой). В ДНК фага Л дикого типа имеется 5 ЕсоК!-сайтов, причем три из них располагаются в центральной области, где локализованы несущссп~снныс гены, алла сайта загра~ивают важ~~ыс гены (см. рис. 7.6).
Конечно, сайты рестрикции, нспользуемыс для клонирования, нс должны затрагивать суз цествсщ1ыс Гены. 1!Оэтому авто)эы отоб(залп жизнеспособные варианты фагов, у которых два послелних сайта были изменены. На их основе были созланы векторы серии ).8! (8спега! гпщзбцсг!оп), причем для увеличения их емкости в них была внесенаделеция пьл5 размером 2,8 т.п.н. В базовой консгрукции ) 8! отсутствуют центральныс фрагменты В (4,8 т.п.н.) и С (5,5 т.п.н.), поэтому сс, казалось бы, можно было испол ьювпь как вектор внедрения. Размер такого вектора (48,5— 2,8 — 4,8 - 5.5 — -- 35,4 т.п.н.) был бы нслостаточен для упаковки в фагов)ло головку„что лавало бы возможность прямого отбюра рекДНК в виде фаговых час~ни.
Однако на практике подобные векторы можно использовгггь, если только предлагаются способы наработки их ДНК. Известны лва таких способа — внедрение в вектор плазмидного рсплнкатора (см. "фазмиды" в лапшой главе) или буферных фрагментов, увеличивающих его до размеров, которые обеспечивактг упаковку вектора в головку фага. Второй способ реализован в векторах замсгцсния 881-).ВС, )8!-),В и 881-).С, в которых сохранены Есо!(1- Глава 7. Векторы див клокирокакия е бактериих 209 рестрикты В и/или С !см.
рис. 7.6). У вектора ),й!!УЕВ-ХВ в гень1 Их Е и 5 введены супрессорчувсгвительные мутации, в результате чего его выживаемость в клетках Е. сой дикого типа 1имитапия природных условий) бьша снижена до величины менее 10". Этот вектор используют при необхолимости обеспечить нужный уровень биологической загциты (см. раздел "Меры безопасности" в приложении).
В векторе 7,781 в качестве буферного фрагмента использован ЕсоК1- рестрикт с бактериальным геном хирГ. Этот ген супрессирует амбермугацик> в гене!ас, находящемся в хромосоме репипиентных клеток. Поэтому клоны, в которых произошла замена гена па чужДНК, отбирают по отсутствию у них фенотипа 1 ас', что отражается на окраске негативных колоний, выросших на спепиачьных средах.
Кроме векторов, приспособленных для работы с рестриктазой ЕсоК!, во второй половине семидесятых годов были созданы векторы и для многих других рестриктаз. Принципы их конструирования сходны с вышеописанными. Например, широкое распрогдранение получили векторы-хароны (В!а! !пег ег а! „1977), названные так по имени мифического перевозчика через реку Стикс. Для удаления из правого плеча харонов нсжелателы пях сайтов рестрикции были использованы аналогичные по функциям учасгки ДН К других лямбдоилных е)янов, а также различные делеции. В центральной части замещения, лелеции, дупл икании и вставки подбирались так, побы ввести в векторы нужные сайты рестрикции.
В результате с помощью полученных векторов можно клонировать фрагменты ДНК разной длины, используя при этом различные рестриктазы. Всего было сконструировано несколько десятков харонов. На рис. 7.7 представлена схема вектора ХС)з4А. Сайты ЕсоК1 были внесены в него с помощью генов 1ас и Ь1о. С этой рестриктазой его используют как вектор замен!ения (максимальная емкость 20,1 т.п.н., минимальная — 7,1 т.п.н.) для конструирования геномных библиотек эукариотической ДНК (см.
гл. 9). 1'екомбинантные фаги приобретают фенотип 1ас Вю, что можно использовать для их отбора. С ресгриктазой ХЬа! харон ).Сп4А используется как вектор внедрения !емкость 6 т.п.н.). Вектор содержит амбер-мутации в ~снах А и В, поэтому реципиентные клетки должны обладать генами-супрессорами (рекоменлунпся клетки 1.В392, см. табл. 7.1). Эти мутации введены с пельк1 поиска рекомбинантных клонов методом рекомбинации ги иоо (Яеее), !983; см. гл. 9).
210 ь!Яств П. Еепнил шыкснерия зн т(го Песушестксавак область ПрэзОс плс'|О Все|ар Лскас плече Гавсккв Отрос шк Ь2 выш |вдявш Н с! се|О Р с(к (| Я К в хв в '„(вс5 й - ! Ь!в258,' — (Ктб — (шв5) (!)ЯЫО ) ЛСЬ4А Яввф гы авва (ЫЯР)- () !|ЧВ ! . -(КД)-' (Ы) ---- ЛВМВЛЗ моя~ а ' мсяявш ч' Вявр) — 1 ) . Ь!с,' — (КН)-в .. (шв5) — - Л2001 моя ч ! моя Яюл Ч' — (ЫЯР) -()-1Ыв ."-Рнбл «акс) — ЛВАЯ)! (н тг н (ч лра гс( явш ~(2! . -- (ваи) .. — . ЛОВРЯ рссгр ! (ивр ш".' ЛР Нвт", - . сав (гы5)- Я вЂ” ЛрМУР!3! мсяс — т Лрк Нсаря' ! 1- ~~)--.-ош~- .
- втн .— (сш5) Я .. ЛХАР Рис. 7 7. Современные фагоаые некторы, сконструированные на основе Л Д Н К: МСЯ вЂ” сайт поликлонпровапп. Сайты рестрикции:  — ВаглН(. Š— Есойй Н вЂ”. Кбпк(Н1, 8 — 5аН, Х вЂ”. ХЬо1. МГВ вектора Л2001: ХЬа! — Яас1 — Хйа!— Ва|лН! — П(лс(Н(-- Есор! — ХЬа(; МСБ-гет — порядок сайтов обратный.
МСВ вектора Л()АЯ!1: ХЬа( — Яаб — р!3 — Есой! -Ва|л11! — Ил()1!!— 5ас! — Хйо! — ХЬл(; МСВ-геч — порядок сайгон обратный, но влгесто промотора фвп| ТЗ (р 1 3) стоит проиотор фага 37 (р!7). МСЕ' вектора ЛРМ тр(31: Ва|лНМ вЂ” ХЬс( — Яай — Ргг! — ЯРЫ вЂ” Н(лс(!!1. МС8" вектора )рМ|Е!31: ВатН!а — Яма! — Крм -- Яас! — Есой!.
МСБ вектора Л2АР: рТЗ вЂ” Яас(— Ног! — ХЬа( — Яре( — Всшм (я — Ясла!е — Ессй! — Н(л(((Н я — ЯаНЫ— Хйо! — Крл1 — рТ7. Значок я указывает, что сайт не единственный. Стрелка укатывав| на положение сайта рестрикции нли полилннкера. ( ) — делеции; — вставки; ' — с!пьсвйт инициации гесА-зависимой рекомбинации; КН вЂ” лелеция КЫ54 генов гсх и с!; 05В80 — во|евка из ННК фага (|80; |2! —. вставка покуса иммунитета фага 21, ! и Т вЂ” сайты инициации и терминации репликации фага И в векторе ).УЛР 1лава 7.
Векторы для еяоиироеаиия е бактериях 211 Емкость вектора замещения ),ЕМ ВЕЗ (Епас!зав( ег а!., 1983) 7 — 20 т.п.н., что позволяет использовать его для конструирования геномных библиотек (см. гл. 9, рис. 9.1). Его буферный фрагмент содержит гены гег! и 8ат, а сам фрагмент ограничен с обеих сторон полилинкером, в который входят сайты клонирования Ла!1, ВатН1 и ЕсоВ! (см. рис. 7.7). В рекомбинантных фарах гены «еВ и 8ат отсутствуют, что делает возможным их отбор по Вр! фенотипу. Более универсальны благодаря сайтам поликлонирования векторы 7.2001 (Кагп еГ а(., 1984) и ),ФАВН (Вог8е, 1983), которые также предназначены для конструирования геномных библиотек.
Их емкость 1Π— 22 т.п.н. Промоторы фатов ТЗ и Т7, имеющиеся на концах полилинксров у вектора ).1ЭЛБН (см. рис. 7.7), позволяют транскрибировать любую из нитей встроенного фрагмента Д11К. Полученные транскриптгя можно использовать для "прогулок по хромосоме" (см. гл. 9) с целью генетического картирования. Отбор рекомбинантных фатов ведут по Вр! фенозипу, используя рекомендуемый штамм ММ539 (см. табл.
7.1). Векторы внедрения имеют меньшую емкость, и поэтому использукпся главным образом для создания банков кДНК. В векторе ) 81 !О (емкость 0--6 т.п.н.) единственный Есо(Н-сайт находится в гене репрессора с1, которгяй взят от фага 434 (см. рис. 7,6,), Вставка кДН К в этот сайт инактивирует ген, поэтому рекомбинантные фаги легко выявляются с помощью бактериальных штаммов, содержагпих мутацию У(ГУ-. Вектор ),8111 (емкость 0 — 7 т п.н.), у которого единственный Есор!-сайт находится в концевой части гена !ась, предназначен для экспрессии клонированньгх кДНК, если они оказываются в одной рамке с начальной частью этого гена (Нвуп)з еГ а!., 1985). Образующийся рекомбинантный белок может быть выявлен иммунологическим скринингом (см.
гл, 9). Мутация Еаш100 в непермиссинных клетках обеспечивает наработку белка в больших количествах, а термочувсгвительная мутация с11а позволяет управлять процессом лизиса клеток. Сходная идея осуществлена и в векторе ),ОВГЗ (Ме!азпег ег а!., ! 937), имеющем полилинкер в 5' кодирующей области гена!ас7 (см.
рис. 7.7). Клонирование кДНК в рамке с геном Iас7 позволяет осуществлять его экспрессию и иммунологический скрининг рекомбинантпых клонов. Максимальная емкость этого вектора 9 т.п.н. ? 12 Часз ь П. Геллля ль аселерил гл Ыуел Некоторые фаговые векторы в зависимости от состояния их агг-сайта и гена глг могут лизогенизировать реципиентные клетки. Такими векторами удобно пользоваться, если необходимо ллительно поддерживать в клетке клонируемые гены. В этом случае амш|ификация ~снов и их продуктов постигается индукцией лизогепных или иг~фицированием реципиентных клеток рекомбицантным фаюм, Сборка фагов ). ог нгго.
граговые векторы и созданные на их основе рекДНК можно вводить в клетки Е со!7 метолом трансформации, называемой в таком частном случае трансфекцией. Однако эффективность этого метода невелика. В норме ) ДНК трансфвцирует клетки с выхолом около 10' негативных колоний на 1 мю ДНК, но после операций ьч игго эта величина палает на олин-лва порядка.
Поэтому обычно применяют метод инфицирования реципиент ных клеток реконструировапными !и лгут фагами, позволяющий повысить эффективность ввода в клетки рекомбинантных фалов на лва-три порядка и получать до 10' — 10" негативных колоний иа 1 мкг векторной ДНК, полвергпугой реакциям рестрикции и лигированля. Предложены лва варианта сборки — с использованием одного или двух бактериальных штаммов. Они отличаюзся подходами к решению главной проблемы — к прелотвращению упаковки ьл «!яо эплогенной сбаговой ДНК в фаговые головки при подготовке упаковочных препаратов.
В первом варианте (Нойп, Мцггау, !977) в пробирку с ) ДНК добавляют опрелеленные количества двух лизатов, один из которых содержит дефектные фаю овые головки (струкз ура П, см. рис. 4.2), а другой — все белки головки, кроме основного (арЕ). Эти лизаты получают инлукцией теплом лизогенов, содержащих, соответственно, профаги Хс!гх аппп 5агп7 Ъ2гед и ).с1гз Еаш Лапз7 Ъ2гег!. Мутации профагов создают оптимальные условиядля сборки фагов ьл иугв. В частности, леле ция Ъ2 препятствует исключению ДН К профагов из бактериальных хромосом и тем самым устраняет возможность ее упаковки в головку фага в самой клетке.
Му«ация ат7 в гене Ю на порядок увеличивает выхол фаговых продуктов из клетки. Мутации лег) в профаге и гесА в лизогенных бактериях предотвращают появление в лизатах рекомбинационных ферментов и Глава 7. Лекторы для кконироеоник е бактериях 213 возможную рекомбинацию !и гйго между добавляемой ДНК и следами фаговой ДНК, находяп!ейся в лизатах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
