Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 15
Текст из файла (страница 15)
3.4). ~томатогичесви Вехомбинмвм .)1 Рис. 3.4. Механизм разрешения каиптсгратов: а — образование коиитеграта; 6 — раз- решение коинтеграта ° — саит разрезания коиитеграта Своеобразным способом стабилизации популяции клеток, содержащихнекоторые плазмиды, является постсегрегационная гибель бесплазмидных бактерий. Зтоявлениеосновано на том, что такие плазмиды синтезируют одновременно ядовитое для клеток вещество и противоядие к нему. Яд стоек, а противоядие нестойко. поэтому необходим его постоянный синтез, что возможно только в присутствии плазмиды.
В клетках, потерявших 74 ь)ость 1. Генная инженерия 1н иго плазмиду, яд демаскирустся и убивает клсз ки (рис. 3.5). Яд представляет собой белок, имсющий разные мишени у различных плазмид, а противоядис — либо также белок, либо асРН К, действующая против транскрипта "ядовитого" гена. ":-- ~,ь ~ ~~ '.~ ш зс1 и .с и г) Рис.
3.5. Механизм гибели клеток, потерявших плазмидьс под коитроясм плазмиды (а) сикжзируется одновременно яд (С)) и противоядис (А); при потере плазмицы (6) проз.ивоядис быстро распадается (ы), и клетка погибает (г) Фенотипичеекие признака. Плазмиды придают клеткам различныс фснотипические признаки: устойчивость к антибиотикам (ампициллину, тетрациклину, хлорамфспиколу и т. д.; всего более 20), катионам (висмута, кадмия, кобальта, ртути, свинца, сурьмы), анионам (арсснату, арссниту), мутагснам (акридинам, этидиум-бромиду, УФ-свету), бактсриоцинам. Клетки с плазмидами способны: вы- Глава 3. Плазмидм 75 зывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина, никотин-никотината, п-алканов, салицилата, толуола; синтезировать антибиотики, бактериоцины, гемолизин, инсектициды, пипиенты, поверхностные антюены, сероводород, токсины, фибринолизин„использовать в качестве источника углерода различные сахара и пеобычныс аминокислоты; конъюгировать с реципиентными цпаммами бактерий; индуцировать опухоли у растений; осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК.
Плазмиды, которые не выявлякпся по фенотипическим признакам, называют криптическими. Итак, основными биологическими свойствами плазмил являются их способность к репликации, конъюпзтивносгь, интегрирусмость, несовместимость, стабильность и фенотипическис признаки, которые опи придают бактериям. Рассмотрим, как эти свойства обусловливаются генетическими особенностями плазмиды Г, а также некоторых наиболее изученных представителей семейсьв Е- и Со1-гпазмид. Р-плазмида Гелелгика. Птазмида ~ представляет сооои малокопииную коньюгативную эписому клеток Е. сой К-!2, относящуюся к 1псР1- группе несовместимости и обладающую строгим контролем репликации. Размер ее кольцевой ДНК составляет около 100 т.п.н.„у пес идентифицировано около 60 генов (рис. 3.6).
Попадая в клетки, эта плазмида изменяет их фенотипические свойства. Клетки приобретают пили и чувствительность к фатам МЯ2, П и 12 (для них пили являются рецепторами), а также становятся донорами ДНК и блокируют конъюгапиогщый перенос в них чужой ДНК (явление поверхностного исключения). В районе генома с координатами 47 — 53 т.п.н. располагаются гены и сайты, отвеюгвенные за стабильное поддержание Е-плазмиды в клетках, в истности, за вегетативную реггликацию (гер-область) и распределение молекул )пазмидной ДНК по дочерним клеткам (рагобласгь).
Этот участок, вы пенепный из Р ДНК, сохраняет все репликативные свойства и свойство несовместимости исходной плазмиды, поэтому его назыли мини-Р-плазм идой. В нем имеготся два окьсайта. В сайте оп Ъ' с помощью продукта гена герС инициируется двунаправленная репликация, но основную роль играет сайт опт, с которого начинается однонаправленная репликация. Рядом с огБ-сайтом располагается 76 Часть 1. Генная инженерия 1п ии> ген герЕ, продукт которого необходим для инициации репликации и контроля числа копий плазмиды.
Необычным является тот Факт„ что промотор это~о гена распознается он-субъсдиницей бактериальной РНК-полимеразы. Свою Функцию ЕерЕ-белок выпол~гяет, связываясь с 19- гленными повторами, расположенными в локусах тсВ и тсС. а также в промоторе собственного гена (рис. 3.7). Действуя на те же локусы входящей плазмилы, этот белок блокирует ее репликацию, что приводит к явлению несовместимости Г-гглазмид. аа --в газе Рис. З.б. Генетическая карта Г-плазмидьь Стрелка в онТ вЂ” направление переноса ДНК при конъюгапии; стрелюе в он 'е' — направление репликации; стрелки нал генами— направление их транскрипции; координаты даны в т.п н.
Глава 3. 77лазмиды 77 Распределение Р ДНК по дочерним клеткам ведут продукты, кодируемыс областью раг. Она включает два гена раг и сайт рагС. Через этот сайт, по-видимому, плазмидная ДНК связывается с помощью белков Раг с определенным участком цитоплазматической мембраны. Конкуренция сайтов рагС, принадлежаших резидентной и вошедшей плазмидам, приведет к потере одной из них, что также проявится в виде их несовместимости. Ят Р прт: п»В +о««С яя~РРб:-л1:ь — -- — ---: — -=-~. з«! опЯ Ф «о«я н 6 В$уу!ууууу»у!Х(,)з ..$.!:~ Ф.:- —::-.— —."-: —" Ф) ! Г:~: « ряс103 Цж" ~~: У)7«' 1.'1 ...ьД Ф»' " "" — —.:«$ — — — — вх ю !ГЪ вЂ” — 4Ф $ )1  — .
- — 4 3 ~ уУ«ио«от "'"""" ! а рн,««тх Р«„ра роорА и опк - ° Рис. 3.7. Строение гер-локусов плазмид Е, Р1, рбС101 и К!. р — промотор (вертикальная штриховка); — о(иаА-бокс; флажок — повтор, связываюший КерЕ- или КерА-белок (направление флажка указывает на ориентацюо повтора); р — инициируюший колон„ч — терминиру1оший колон, АТ вЂ” АТ-богатый участок. Стрелки нал промоторами и генамн указыяают на направление транскрипции Мини-Е-плазмида содержит информацию и о других функциях„стабилизирукнцих плазмиду. Продукт гена ген ведет разрешение коинтегратов через сайт 7сг.
Гены асс( отвечают за постсегрегационную гибель бесплазмицных клеток (Яа(уе ег а!.„1985). Ген сссБ кодирует белок (яд), инактивирующий субьединицу А гиразы, что приводит к появлению двунитсвых разрывов в бактериальной ДНК. В плазмидосодержаших клетках продукт гена ссг)А, соединяясь с 78 Часть 1, Геллал инженерил ьл иапо белком СсйВ, противодействует этому.
При потере плазмиды белок СсбА за 2 — 3 генерации клеток расщепляется протеазой Еоп, вследствие чего клетки гибнут. Конвюгативность За конъюгативныс свойства Г-плазмиды отвечает оперон па, содержащий более 25 генов (см. рис. 3.6), которые функционально делятся надва блока. Олин блок, названный тр~(танп8 рай 1оппапоп, гены от лаА до ггаО), отвечает за установление физического контакта между донором и реципиентом и образование поры (мостика) между ними. Первичный контакт обеспечивается кончиками пилси, основной белок которых— пилив — кодируется геном глдА. К этому жс блоку, по-видимому, следует отнести и гены ггаТ и л иЯ, отвечающие за поверхностное исключение Второй блок генов — ггаМУР1 — детерминирует передачу ДНК в реципиентные клетки.
Это осуществляется путем введения эндонуклсазой (никазой) Тгау однонитевого разрыва (ника) в сайт опТ, расплетения нитей ДНК гсликазой Тга! и перемещения нити с 5'-конца в реципиентную клетку так, что опсрон гга передается последним. По мере переноса эта нить дуплицируется в рециписнте. Интересно отмстить, что восстановление дуплекса в донорной клетке идет не по механизму казягдегося кольца, хотя для этого имеется свободный 3'-конец, а путем инициации синтеза новои нити ДНК, которая замегдает передаюц[уюся нить (рис.
3.8). У Г-подобных плазмид экспрессия опсрона гга позитивно регулируется геном па). продукт которо о включает независимо транскрипцию гена !гаМ -- инициатора переноса плазмидной ДН К и опсрон из генов ГгаЪ' — гга1. В свою очередь экспрессия гена !га) негативно регулируется асРНК, кодирусмой ~еном2!лР.
Экспрессию же гена /!лР позитивно регулирует продукт гена ~тО. Впрочем, гга-оперон самой Г-плазмиды экспрессирустся конститутивно, что объясняется инактивацией гена !!лО элементом 1БЗа. Структурными компоненгами, обеспечивающими интеграцию Г-плазмиды в бактериальную хромосому, являются элементы 132„ 153а, 1ЯЗЬ и Тп! 000, входящие в состав плазмидной ДНК. Они взаимодсйствукя с аналогичными элементами бактериальной ДНК через сайт-специфическую или ВесА-зависимую рекомбинацию и встраиваются в нес в разных местах и направлениях в зависимости от локализации и направления бактсриальных элелгецтов Глава 3.
ГЫазмрдьг 79 (рис, 3.9,а,б„в). Клетка после гиггтеграции в ее хромосому г-плазмиды приобретает свойства НГг-клетки (рис. 3,10), т. е. способна с высокой частотой ориентированно передавать свои гены в реципиенты. Это пример генной инженерии гл угро, осуществляющийся в природе с помощью плазмид. К чего »ыя стенке Персемоныяся нять ро!Ш Бс»ок 55В Х леер а ° 3 огечныоы»» ыггь Поре н лоннчеы: нг никс»ы гтг глу! н геяикнгы (тека рснинисит донор Рис. 3.8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
