Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 72
Текст из файла (страница 72)
380) были выращены плодовитые трапсгенныс растения. Во всех их клетках обнаруживался ген осе (о его присутствии судили гто синтезу клетками октопина). В результате самоопыле~ия двинь!х растений и полового скрещивания их с обычными растениями табака было установлено, что ген вез наследуется как доминан.н!ый мендслсвский признак с сегрсгаписй, типич!юй для !юлигибридного скреп[иванна.
чк рввз22 -.~, ',ж ' .рв!гззв-м есок! Рис. ! 2.2. Строение коинтсгративных векторов рС~3!3850 я РСЬ'! !03 и их коинтс!рата. Стрелками указаны направления считывания генов. Знаки В' в дуплексе обозначают прямые ксшгсвые повп!Ры ТзДНК; чужДНК представлена темным !1!рагмензсл! Этот успех привел к мысли о конструировании векторов на базе Т-ДНК путел! замены их пснтральной части чужеродными генами. Расчет строился на том, что в составе Т-ДНК они будут естественным образом пере!н>ситься в растительные клетки и интегрироваться в их геном. Первой конструкцией, в которой была осуществлена эта идея, явилась плазмида рС!'!!3850 (рис, 12.2), созданная путем замены локуса олс нопалиновой плазмиды рТ!С58 плазмидой рВК322 (Хапзбгув)г) е! а!'., !983).
Агробактерии, несущие плазмилу рОЪг3850, передавали измененную 376 Часть В!. Экснрессня >у>керодных генов Т-ДНК в растительные клетки, о чем свидстельствова:ю появление в них падалица. Из трансформировацньгх клеток бьщи выраьпсны плодов>п ыс трансгснныс растения. Маркеры. В случае использования неонкогснной Т-ДИК синтез опинов служит„конечно, показателем трансформированности растений, но этот признак не является сслсктивным.
По этой причине при конструировании распггельных векторов используют нс сами гены оса и лов, а их промоторы и сайты полиадснилирования, между которыми помсщак>т бактсриальныс сслсктивные маркеры. Набор таких маркеров, функционирующих в растительных клетках„невелик. Это неомицинфосфотрансфераза (гены лрг! или лрй! транспозонов Тп601 или Т5, их общее название лео; усн>йчивость к аминогликозидным антибиотикам канамипину, неомицину и С4!8), гигромицинфосфотрансфераза (ген Ьрт Е.
сей, устойчивость к гигромицину), хлорамфениколацетилтрансфераза (ген саг транспозона Тп9, устойчивость к хлорамфсникалу), дигидрофолатрсдуктаза (ген с!>>)г плазмиды К67, устойчивость к меготрексату), 4>с>сфинотрицинацстилтрансфераза (ген бог Ьугерсоьтусех *ну8говсор1сив, устойчивость к гсрбициду фосфинотрицину и его производным) и др. тлоиитегративиые векторы. К таким векторам относят цлазмиду рСУ3850 и ей подг>бнь>с плазмиды, которые слишком велики для манипулирований >и и>го, и поэтому чужеродные гены вводят в цих гомологичсской или сайт-специфической рскомбинацисй, используя промежуточные векторы (рО>>1!03 в нашем примере, рис.
12.2). Их конструируют на базе плазмиды рВК322 или ес производных, вводя в них фрагмент с Т-ДНК и дополнительные сслсктивныс маркеры для работы с агробактериями и растительными клетками. Чужеродные гены вагавляют в Т-ДНК, а затем рскомбинантный промежуточный вектор переносят методам кон ьюгации в клетки А. пгтеГос>епгн содержащие плазмиду рл>У3850. Для этого используют две совместимые вспомогательные плазмиды, как правило, р)лх28 и К64с)гс)П, которые также совместимы с рВК322. Первая способствует мобилизации Со!Е1-цодобных рспликонов, а вторая — их конъюгапиоцному переносу в клетки отдаленных видов. После конъюгации по 1 лава 12.
Растения 327 селективному маркеру (К>п" в нашем примере) отбирают клегки А. 1итеЕас)ела с перешедшими в них рскомбинантными промежуточными векторами. Ни одна из перешедших плазмид, включая вспомоггггсльные, не способна к самостоятельной репликации в рсципиенте.
Поэтому отобранные клетки содержат только коинтеграт плазмиды РС)Н3850 с рекомбинантным промежуточным вектором, ображ>вавшийся путем рекомбинации по областям гомоло! ии. Чужеродные гены переносятся затем в растительпыс клетки в составе рекомбинантной Т-ДНК, а трансформанты отбирают по второму сслективному маркеру (леа в нашем примере). Сходная идеология используется в коинтсгративных векторах, основанных на использовании системы сайт-спепифичсской рекомбинации 1ахР-Сгс фага Р1 (Мого, Нооуйааз, 1992). Яинарнь>е векторы более просты, более эффективны и потому более популярны. В бинарной системс Т-ДНК и иг-область находятся в агробактериях на разных совместимых плазмидах, и, тем не менее, такие а>робактерии могут осуществлять трансформацию растений !Ноева ег а1., !983).
Векторы, несущие неонкогенную Т-ДНК, конструируют на базе плазмид с широким кругом хозяев„что позволяет манипулировать ими в клетках Е. саД и А. гитеуас>ела Например, широко используемый вектор рВ)п19 а -и оазв>о>о Рис. 12.3. Системы бинарных векторов с Т-ДНК (а) и без Т-ДН К 1б). н)г-Функция плазмиды-помошника рА).4404 обеспечивает перенос в растения модифицированной Т-ДНК вектора РВ)п19 1а) и всей плазмиды р)Р18! 1б). Знаки > вдуплексеобозначаоз прямые ко>шевые повторы Т-ДНК; МСЯ вЂ” полилипкер плазмиды р()С19 378 Часть И!. Зкенреееив нужеродвых генов подлержиьается репликатором плазмпды рКК252 (группа несовместимости 1псР).
В его Т-ДНК внедрен фрагмент из плазмилы р()С!9, включаюшии начальную часть гена !асУ. с полилинксром, а под промотором гена лох находится селективный маркер лео (рис. 12.3,а), Операции по клонированию чужеродных генов и отбор рскомбинюггных клонов по эффекту о-комплементации ведут в клетках Е. со!8 Рекомбинантный вектор переносят в А. гиглетос!елх трансформацией или ко!гьазгацисй с использованием вспомогательных плазмид и маркера КиР. Плазмидапомоьцник рА1А404, содержащая ю.-область, способствует переносу рекомбинантной Т-ДН К из агробактерий в растения.
Ьинарлые векторы без Т-ДШ!. В гл. 3 отмечалось сходство между механизмами конъюгации и переноса Т-ДНК в растительные клетки. Сходство оказалось настолько близким, что некотор!ае плазмиды могу! переноситься с помощью своих систем мобилизации через каналы, образованныс т!г-системой Т1-плазыид. Впсрвые это было продемонстрировано на примере бинарных векторов р!Р18! и рА).4404 (ВвсйапапУуо))ах!оп ег а/., !987) Вектор р)Р!81 (рис.
12.3,6) сконструирован на базе репликона и гноЬ-системы плазмиды КВГ1010 (см. рис. 3.13,6). В присутствии плазмилы-помощника рА1.4404 зта система успешно использована для переноса всей плазмиды р)Р181 и солержашихся в псй чужеродных генов из бактерий А. гдте~ас!ет в клетки табака. Плазмидная ДНК была обнаружена в хромосомах всех отобранных по признаку устойчивости к канамицину растительных трапсформантов.
И-вектлоры. Уже говорилось (см. пь 3), что способностью трансформировать клетки двудольных растений обладыот также определенные К)-плазмиды А. г(во8елегь Т-ДНК В(-плазыид обнаруживается в нескольких копиях в хромосомах трансформированных клеток корешков. Эти клетки нсонкогенны. Они синтезируют опины, быстро растут в культуре и из них можно рсгенсрировать здоровые плодовитые растения. Г!озтому К)-илазмиды как природные неонкогснпыс векторы более привлекательны, чем Т!-плазмиды. На их основе были созданы интегративные и бинарные векторы. Глава ! 2. Рас~иеаия 379 Вирусные векторы пе получили широкого распространения.
Характерной чертой эукариотических вирусов является компактное строение их генома и практически полное отсутствие генов, несущественных зшя их развития. Поэтому клонирование с их помощью чужеродной ДНК вызывает их дефектность и требует использования вирусов-помощников. Напомним, что среди вирусов растений "ДНКовые" сосгавляют меньшинство. Ранее они рассматривались как средство достанки чужеродных генов в те растения, которые не полвержецы инфипированию агробактериями. Однако по мере разработки новых методов трансформации расгительных клеток (см.
далее) необхолимосгь в этом отпала. В настоящее время применение вирусных векторов ограничено„как правило, исследованиями в области вирусологии растений. Определенный прогресс достигнут только с двумя группами "ДНКовых" вирусов — каулимовирусами (инфицируютдвудольные растения) и гемини вирусами (ипфицируют одно- и лвудольцые растения). Серьезным недостатком векторов, сделанных на их основе, является о~раничепие по размеру упаковываемой в капсулу ДНК. Первая группа прслсгавлепа вирусом мозаики цветной капусты (СаМУ), имеющим кольцевую двунитевую ДНК ,'шиной 8024 п.н. Из восьми генов только два несмежных несущественны для развития вируса.
Их замена позволяег внедрять фрагменты ДНК размером всего лишь в несколько сотен пар нуклсотидов. Заражение этим вирусом является системным, т.е. вирусы распространяются по всему растению. В растительных экспрессионных векторах широко используют сильные промоторы вируса СаМУ -- 535-РНК и гена П, которые на 1 — 2 порядка эффективнее, чем, например, промотор гена лог. Геном геминивирусов представлен одной или двумя молекулами кольцевой однонитевой ДНК обшей длиной 2,7 тыс.
нуклеагидов. Изолированная вирусная ДНК, натнвпая или в двунитевой репликативной форме, не является инфекционной. Оказалось, олнако, возможным ввести эту ДНК в раогительные клетки с помощью агробактерий (Сплав!еу ег а(., 1937). Тандемный димер вирусной ДНК был встроен в Т-ДНК и с помощью А. 1ите~ас(ела перенесен в кукурузу, у которой появились все 380 Часть !!1 Знснреееия чужеродных генон симптомы вирусного заболевания. Этот прием был назван а гроинфекцие й. Он интересен тем, что позволяет избежать ограничений по размеру рекомбинантной вирусной ДНК н оказался применимым к другим вирусам.
Кроме того, в част!!осги, этот эксперимент свлшегельствуст о возможности инфицирования агроба!сгериями также и однодольных растений. Потенциально векторами могут быть и кДНК РНКовых вирусов. особенно у нитевидных, поскольку упомянутое ограничение здесь нс так жестко. Проводятся эксперименты с вирусом табачной мозаики (ТМУ) и вирусом мозаики косгра (ВМ лг) Трансформация растительных клеток Траисдгормация аграбаитеритгми. В зависилгости от пели экспериментов и степени изученности объекта возможны несколько способов трансформации растительных клеток агробактериями и регенерации нз них целых растений, Простейший из способов предложен для молельных растений (Ногзсп ег а!., 1935).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
