Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 187
Текст из файла (страница 187)
Например, бактерии обрабатывают растворителями жиров, что делает их мембрану проницаемой для предшественников синтеза ДНК (и других малых молекул). Обработанные клетки не сохраняют жизнеспособность, но реплицируют свою ДНК со скоростью, которая лишь незначительно отличается от обычной скорости репликации !и чгяо. С той же целью бактерии можно лизировать на целлофановых дисках, находящихся на поверхности агара. Репликационная система при этом задерживается на поверхности диска, и к ней могут быть добавлены необходимые компоненты. Для того чтобы охарактеризовать отдельные компоненты репликационных систем 1п чйго, необходима мат- 33. Ферментативный аппарат репликации ДНК 421 рица, которая позволила бы исследовать природу синтеза ДНК.
Мы должны быль уверены, что синтез соответствует подлинному репликационному процессу )п Иуо, а не вызван альтернативной активностью, связанной, например, с репарацией поврежденной ДНК. Для получения систем репликации )п уйго можно использовать )жзличные матрицы, обеспечивающие синтез либо отстающих, либо ведущих цепей. Существуют два способа изучения роли отдельных компонентов репликации (п уйго. Первый способ заключается во фракционировании системы, очистке компонентов и повторном их объединении. В другом случае используют мутант с(ца и эксперимент осуществляют при условиях, когда продукт мутантного гена неактивен.
Затем проверяют экстракты из клеток дикого типа на их способность восстанавливать активность этой системы. Такой комплемеитационный анализ ш Игго может быть использован при очистке белка, кодируемойо покусом с(цц. Инициация синтеза одиночной цепи ДИК Образование фрагмента Оказаки на отстающей цепи связано с синтезом ДНК комплементарной одноцепочечной области, образуемой при движении репликационной вилки. Для изучения событий инициации и продолжения синтеза такой цепи ДНК в качестве матриц были использованы трн одноцепочечные ДНК фагов. Каждый из этих фауовых геномов представлен кольцевой одноцепочечной ДНК, получившей название вирулентной или ( + )-цепи.
На рис. 33.1 показано, что синтез комплементарной, или ( — )-цепи, превращает геном в двухцепочечную кольцевую репликатявную форму (РФ) ДНК. Она может находиться в виде или релаксированного кольца (РФП) или суперспирализованного кольца (РФ1). Синтез комплементарной пепи рассматривается как аналог синтеза отстающей цепи двухцепочечной ДНК. Несмотря на то что такие фаговые гепомы проявляют лишь незначительное спаривание оснований в пределах одной цепи и поэтому сохраняются в основном в одноцепочечном состоянии, сама ДНК не является подходящей матрицей для реакции репликации.
Нуклсиновая кислота сначала должна быть покрыта белком, связываюшимся с едноцепочечнцй ДНК (белок БЯВ). Этот белок представляет собой тетрамер с мол. массой, равной 74000, который кооперативно связывается с одноцепочечной ДНК, сохраняя ее в растянутом состоянии.
Суть кооперативного способа связывания состоит в том, что связывание одной молекулы белка облегчает связывание другой. В результате однажды начатая реакция связывания ца определенной молекуле ДНК быстро распространяется до тех пор, пока вся одноцепочечная ДНК не будет покрыта белком ЯЗВ. Следует отметить, что этот белок не является расплстающнм; его функция состоит в стабилизации одноцепочечной ДНК. На рис. 33.2 представлены стадии репликации ДНК фага М13, которая может служить моделью наиболее простой системы. В одноцепочечной структуре ДНК имеется участок, представленный последовательностью из сэ9 оснований, образующих шпильку. Это единственная часть фагового генома, не связывающаяся с белком ЯБВ.
Шпилечная структура обеспечивает сигнал для инициации. РНК-полимераза хозяина инициирует синтез РНК за шесть оснований перед шпилечцой структурой. Цепь Яйнеасаа сна о ~м-дйк ду с ан Лнк, снан а н ос сна й онннеяе нрной юное ей( асс а РФ Я) ноаыен й аун но РЫ рцс, 331 одноцецочечная кольцевая Днк фаеа превращается в лвухцецочечную в результате синтеза комплементарцой цепи. РНК распространяется на длину 20 — 30 остатков, разрушая эту структуру. Белок БЯВ связывается с нематричной половиной шпильки, освобождаемой при образовании гибрида РНК-ДНК. Именно это, вероятно, обусловливает терминацию транскрипции в верхней части шпилечной структуры.
Поскольку реакция зависит от РНК-полнмеразы, она подавляется рифампицином, В настоящее время еще не известно, как РНК-полимераза распознает шпилечную структуру в качестве сайта инициации транскрипции; возможно, в этот процесс вовлечены другие белки с вспомойательными функциями. Делетирование всей последовательности, кодирующей синтез РНК-затравки, не делает фаг нежизнеспособным, однако вызывает его более медленное развитие. Следовательно, должны существовать другие последовательности, способные использоваться в качестве точек инициации, хотя в клетках Е. сой они менее эффективны (а в клетках других бактериальных хозяев они могут быть более эффективными).
РНК-затравка удлиняется с помощъю ДНК-полимеразы П1, которая синтезирует цепь ДНК, распространяющуюся по всей длине кольцевой молекулы до тех пор, пока она не достигает точки инициации РНК. РНК удаляется посредством экзонуклеолитического действия; какой фермент ответствен за эту активность, пока не ясно. Это может быть ДНК-полимераза 1, которая также способна удлинить новую цепь ДНК, устраняя пробел. В результате остается только разрыв между началом и концом комплементарной цепи, который ликвидируется с помощью лигазы. При использовании в качестве матрицы одноцепочечной кольцевой молекулы ДНК фага О4 наблюдается одно значительное отличие в реакции. Вместо РНК-полимеразы хозяина функционирует белок, кодируемый геном с(ца6.
Этот фермент представлен одним полипептидом с мол, массой 60000 дальтон (значительно меныпей, чем у РНК-полимеразы). Фермент назван праймазой. Одна молекула белка ОпаО связывается непосредственно Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 422 Кол ценен аянацелачечнал ДНК со шлилчкой вающийая а еч айДЙК, 5'Т 6 с ТА О САААААОТ ТТТ ООТОАТООТТСАС СТТТТТ66 АОА ССОСТАССОООТО Т 3'ттт с с Т Т А АО Селе»ванне белк ТТТСССО рррОООС РНК-зазравка вмрезаезс, цещ ДН К наращиваеям, оставляя незалеченнмм салака разрез сцз ' ЧЧ с! Разрез () зашивайся )~ д 7( сГ Я 7 "зьтткчсйссбос )( лнсщо () ?( 7 1 Тсччз чрзрз' ) (? л ( 7( -б Ипачсачл чю Ситуация в случае фага фХ174 может служить лучшим примером инициации фрагментов Оказаки, так как синтез ДНК инициируется в нескольких сайтах фагового генома.
Сравнение системы репликации фага фХ!74 с системами фагов М! 3 и О4 лано на рис. 33.3. В случае фага фХ174 необходимо значительно большее количество белков. Некоторые из них идентифицированы как продукты опрелеленных генов, в частности с(ла (данные об их свойствах суммированы в табл. 33.1); о лругих известно только, что они необходимы для реакции (п Р)гго (табл. 33.2).
Первая стадия синтеза у фага фХ174 такая же, как у фагов М13 или О4: ДНК покрывается белком ББВ. Однако затем она превращается с помощью шести белков, и, и', и", 1, ОпаВ и ОпаС, в предшествующий затравке промежуточный комплекс. Такой «предзатравочный» комплекс собирается в специфическом сайте, имеющем вид шпильки, образованной последовательностью из 55 оснований (в участке, аналогичном уникальной стартовой точке в ДНК фага О4). После того как предзатравочный уЪ' — йЧТЧ си зезирчешн фЫ ТТЧ) днк зб 715, 71 тг 7( (~ с ЗЗВ-резистентной двухцепочечной шпилькой в ДНК. Праймаза синтезирует РНК из 29 оснований, которая комплементарна одной цепи шпилечной структуры. В том случае, когда синтез ДНК происходит одновременно с синтезом затравки (вместо того, чтобы следовать за ним), образуется более короткая затравка, иногда содержащая всего шесть оснований.
Затравочная реакция не подавляется рифампицином. Праймаза отличается от РНК-полимеразы и своей способностью использовать в качестве предшественников при синтезе тп Р11го как рибонуклеотиды, так и дезоксирибонуклеотиды. Примеры с М13 и О4 показывают, что РНК-затравка может быть синтезирована либо с помощью РНК-полимеразы, либо праймазы, причем в любом случае используется уникальный сайт, опрелеляемый, по-видимому, вторичной структурой ДНК. Завершение реакции, вероятно, обусловлено топологическими особенностями области инициации и(или) действием ДНК-полимеразы. Удлинение цепи ДНК с 3'-ОН-конца затравки осуществляет.- ся у обоих фагов при участии одинаковых синтезирующих активностей.
Ряс 33.2 Для образования комплементарной цели ДНК фага М!3 ла матричной вирусной ДНК, покрытой белком ББВ необходимы синтез РНК-затравки, наращивание ДНК, удаление затравки, заполнение пробела и залачивание разреза. Движение праймосомы 33. Ферментативный аппарат реплнкацнн ДНК 423 Табляна 33.1 Некоторые компоненты реплнкацнониого аппарата, идентифициро- ванные с помстнью мутаннй лексе с ЫнаВ Праймаза ннипи- 60000, мономер пруст синтез фрагментов О казаки ДНК-полимера- 140000, субъсднза Н1 ница ДНК-полимера- 52000, субъединиза И! ца Залечивает разре- 75000, мономср зы между фрагментами Оказаки АТР-зависимая 66000, мономср геликаза Белок, связыва- 74 000, тетрамср юшийся с одноцепочечной ДНК т)иаб ро!С (блаЕ) т)паХ ~ !!я 20 50 юр комплекс сформирован, праймаза !УпаО способна узнать матрицу; она синтезирует различные короткие молекулы длиной от 15 до 50 оснований, причем инициация происходит во многих сайтах на ДНК фХ174.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
