Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 188
Текст из файла (страница 188)
Следовательно, предзатравочный комплекс образуется в уникальном участке, а синтез РНК инициируется праймазой в нескольких сайтах. Белок и'может быть компонентом, ответственным за выбор сайта, в котором образуется предзатравочный комплекс. Белок проявляет АТРазную активность, которая специфически зависит от 55 оснований шпилечной структуры фага фХ!74. (Образование такой структуры само по себе не обеспечивает сайт узнанания для белка п', поскольку шпилечные структуры ДНК М13 или 04 не могут заменить шпилечную структуру фага фХ174).
О количестве гидролизованной АТР и использовании выделенной энергии данных не получено. Если ДНК фага фХ!74 не покрыта белком %В, необходимость в предзатравочных белках исчезает. В случае чистой одноцепочечной ДНК фага фХ174 для синтеза РНК-затравки праймаза нуждается только в присутствии белка ОпаВ. Комплекс Опа — праймаза также активен при использовании непокрытых белком БЯВ ДНК фагов М!3, О4 или матрицы ро!у (т)Т). При добавлении к ДНК фага фХ174 белка ОпаВ и праймазы синтезируется множество затравок.
Размер РНК колеблется в пределах от 10 до 60 оснований, и, вероятно, их появление свидетельствует о выборе ряда специфических сайтов. Следовательно, комплекс Впа — праймаза способен узнавать серию сайтов инициации на свободной ДНК; такая способность утрачивается в присутствии белка ББВ. Восстановление затравочной активности требует участия других белков предзатравочного комплекса: п, и', и", т н ОпаС. Мы знаем, что последнее отражает действительные события ш ттсо, поскольку белок ББВ необходим для репликации у бактерий. Таблица 33.2 Друтне белки, участвующие в реплвсацнн АТРаза (1 моле- кула на рспли- кацнонную вилку) и" 1 Образование Неизвестен п ) прслзатравочной РНК Неизвестно) ! ) Об этом свидетельствует фенотип шгаммов с быстрой остановкой репликации, определяемый мутацией в гене юЬ.
Комплекс белков, вовлекаемых в затравочную реакцию, получил название праймосомы. Существующее противоречие между наличием уникального предзатравочного сайта и множества сайгон инициации синтеза затравок можно объяснить, предположив, что праймосома первоначально собирается только в одном участке, однако затем некоторые или все белки способны перемещаться по одноцепочечной ДНК к сайтам, в которых действительно осуществляется инициация синтезов затравки.
Движущийся комплекс должен включать белки ОпаВ и праймазу; белок и', по-видимому, входит в состав этого комплекса, так как его способность вытеснять белок ББВ с ДНК, вероятно, необходима для движения. Белок РпаВ также может играть важную роль в движении. На одну репликационную вилку приходится, повидимому, один гексамер белка ВпаВ. В присутствии АТР белок с высокой эффективностью связывается с одноцепочечной ДНК. В дальнейшем праймаза стабилизирует комплекс ОпаВ-АТР на одноцепочечной ДНК. Замещение АТР на АОР вызывает аллостерическое изменение, которое уменьшает сродство белка ОпаВ к ДНК. Таким образом, для того чтобы дать возможность белку ОпаВ отделиться от ДНК и переместиться из одного сайта инициации затравки в другой (где АОР замещается на АТР), может быть необходим гидролиз АТР.
В настоящее время в отдельных плазмидах обнаружены сайты, которые формируют праймосомы. Сравнение последовательностей этих сайгон у разных штаммов, их анализ у мутантов дает возможность определить чем они отличаются от других последовательностей ДНК. Использование линейных фрагментов ДНК фага фХ174 позволило идентифицировать связь между уникальным сайтом предзатравочного комплекса и множественными сайтами инициации синтеза затравок. Праймосома, по-видимому, перемещается первоначально в направлении, противоположном направлению удлинения цепи-вдоль родительской цепи от 5'- к 3'-концу.
На рис. 33.4 показано, что такая ситуация соотнетствует условиям инициации синтеза фрагментов Оказаки отстающей цепи дуплексной ДНК. При продвижении репликационной вилки со стороны 3' образуется одноцепочечная Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 424 РИК. лап»мерзее Опеа О Белок Ззь Е Прзймззз Прзимззз 1 ! ! ! — — — — — и М а»метели» е сзйты иииц щии ОпаВ, Олзе Прзймззз ! и г Де кение прзймосомы 5' з з 5' Преймосоме инициирует синтез фрегмеятз Океззки 5' 5' 3' 5' его Фрагмента Окезеки 3' 5 Прзймосомз продолжеет деижеиие — Родитемскзя цепь — дотерияя цепь дНК вЂ” РН К.ззтрзекз Рис 33.3 Репликация свободной ДНК может быль янициирозана яо множестве сайтов с помощью комплекса Ован-прайыаза. Реплнкапия ДНК фатов М!3 и О4, покрытых белком 5ЯЬ, зннцнируется только в одном санте.
ДНК фага ФХ174, связаниая с белком 55В)ИВЫ, требует нескольких дополнительных белков !ля образования предынипиациоиного комплекса В уникальном :айте; затем имеет место инициация в нескольких сайтах. " Преймосоме перемещается едопь родительской цепи е иепреелеиии 5' 3 Рис, 33.4. Для образования отстающей цепи прайыосома сле!уст Вдоль матрицы за репликационной вилкой в направлении У 3', периодически инициируя синтез фрагментов Оказакн.
область перед праймосомой. После каждого события инициации праймосома передв!Пается вдоль одноцепочечного сегмента к сайту инициации синтеза следующего фрагмента Оказаки. Следовательно, праймосома движется в том же направлении, что и репликац~онная вилка, но в противоположном направлению синтеза ДНК отстающей цепи. Чтобы установить соответствие между реакцией синтеза, охарактеризованной для ДНК фага фХ!74, и репликацией двухцепочечной ДНК, мы должны рассмотреть, каким образом одноцепочечная матрица готовится к синтезу отстающей цепи.
По-видимому, по мере продвижения репликационной вилки, белок ББВ связывается с ДНК, удерживая две родительские цепи разделенными. В результате обе цепи (или по крайней мере отстающая) оказываются в условиях, необходимых для нх использования в качестве матриц, Белок ЯБВ в репликационной вилке должен присутствовать в стехиометрических количествах. Какой белок ответствен за первоначальное расплетанне двух цепей родительской молекулы? Эту функцию связывают с мутациями гер, которые замедляют движение репликационной вилки. Белок Кер представляет собой АТРазу, зависимую от одноцепочечной ДНК. В присутствии АТР совместное действие белков Кер и ББВ приводит к разделению двухцепочечной репликативной формы ДНК фага фХ!74, несущей разрыв в одной из цепей, на составляющие ее отдельные цепи.
Вероятно, белок Кер расплетает цепи, а белок ББВ затем фиксирует нх в одноцепочечном состоянии. Возможный механизм действия белка Кер представлен на рис. 33.5. Белок связывается с одноцепочечной 33. Фермеитативный аппарат репликацни ДНК 425 3' 5' Ген Функция 3' 5' Ын«А Ан«В 3' 5' Ын«С 4»ат Ынг«г Лн«К 3' 55ЧОЬКОЬ«'ЬО.
' Ап«Р '~МООРОМ»5М 5' рнс. 335 Белок Кер может двигаться вдоль одной нз цепей ДНК, вытесняя вторую цепь. областью в двухцепочечной ДНК, перемешаясь по ней в определенном направлении. При достижении двухцепочечного сегмента он вытесняет цепь, имеющую 5чконец. Расплетание каждой пары оснований требует гидролиза двух молекул АТР. Если роль расплетаюшего белка в реплнкацнонной вилке приписывается белку Кер правильно, то возникает вопрос, каким образом мутанты гер реплицируют бактернальную ДНК, не обладая способностью разделять цепи ДНК фага фх174. Жизнеспособность фага М!3 также ависит от Кер-белка; в мутантных клетках гер потомство (одноцепочечной) фаговой ДНК не может быть получено из кольцевой молекулы, имеющей репликативную форму.
Однако если в ДНК фага М13 внедрен фрагмент Е. сой, содержащий область инициации, то ДНК реплицируется. Следовательно, ДНК двух указанных фагов нуждается в белке Кер для репликации, а ДНК бактериальной клетки способна реплицироваться без него. У Е сой, по-видимому, существует какой-то другой (неизвестный) механизм, с помогцью которого происходит инициация разделения цепей и далее цепи поддерживаются в разделенном состоянии. Инициация репликации в точках начала репликации двухцепочечной ДИК Начало цикла реплнкацнн двухцепочечной ДНК требует двух типов активностей наряду с теми, которые необходимы для синтеза фрагментов Оказаки.
Во-первых, цепи ДНК должны разделиться. (Существоналн гипотезы, согласно которым приобретение необычной вторичной структуры, изображенной на рис, 31.8, может быль связано именно с этой стадией.) Во-вторых, должен быть инициирован синтез ведущей цепи с помощью механизма, аналогичного или подобного тому, который осуществляет инициацию синтеза фрагментов Оказакн. Однако не исключена возможность существования друго|о механизма.
Изучение мутантов Е. сой с замедленной остановкой репликации позволило идентифицировать несколько покусов, контролирующих события в сайте инициации репликации; однако об нх молекулярных активностях известно очень мало. Из перечисленных в табл. 33.3 локусов только три имеют известные функции. Установлено, что и замедленная и быстрая остановки реплнкацин могут обусловливаться мутациями в покусах Ылав н г(паС; мы Табяння ЗЗЛ Мутации, обусловлнваннане замедлеяную остановку реалнкаанн, недостаточно харон~о охарактеризованы Связана с инициацией реал«кап Одна мутапия обусловливает новку репннкнпни, функпни табл.
33.1 Белок действует совместно с бел Неизвестна » » Устойчивость к фенетнловому спирту; связана с мембраной' имеем некоторую информацию о функциях белков, контролируемых ими в процессе реплнкации. Вполне допустимо, что роль этих белков в сайте инициации окажется родственной. Некоторые мутации покуса олаА могут быть супрессированы мутациями в генах РНК-полимеразы, что свидетельствует об участии белка (ЗпаА в какой-то стадии инициации, требующей синтеза РНК. Точно установить роль белка 13паА пока не удалось, поскольку он с ~рудом полдается очистке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
