Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 185
Текст из файла (страница 185)
ниже и гл. 33) и в случае удаления из ДНК поврежденных оснований (гл. 34). Фермент ДНК-полимераза П1 был открыт при изучении условно-летальных мутаций в ро1С-покусе, который кодирует общий компонент всех препаратов фермент.а— его и-субъединицу с мол, массой 140 000. Очищенные препараты фермента с активностями ДНК-полимеразы 111 состоят из нескольких субъединиц. Мы использовали слово «активпости» во множественном числе, поскольку фермент был получен в нескольких формах, и остается неизвестным, какая из них представляет собственно фермент, включающийся в репликацию гп у)уо.
Данные о различных формах фермента суммированы в табл. 32.3. Все субъединицы, перечисленные в таблице, необхо- 416 Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений Стал удлннаннд нанн в Суаднн нмдааанмл нукваванда димы для проявления полной активности в репликационной системе (п уйго (гл. 33). Были предприняты попытки разделить субъединицы на компоненты собственно ДНК- репликазы и вспомогательные белки. Однако системы ш уйго содержат много дополнительных активностей, н не яаю, существует лн в действительности такой фермент «ДНК-реплнказа», Функция синтеза ДНК может осуществляться лишь частью большого н сложного аппарата реплнкации, у которого выявляемая реплнказная активность является активностью полипептида, непосредственно вовлекаемого в каталнзнруемый рост цепи ДНК.
Бактерия Вас!Вил зибгяй также имеет три ДНК-полимеразы, которые пронумерованы с целью сопоставления с их двойниками в Е, со(Ь Существуют некоторые различия в зкзонуклеолитнческих активностях бациллярных ДНК-полимераз по сравнению с ферментами Е сод. Субъеднница, у которой идентифицирована ДНК-синтезирующая активность ДНК-полимеразы П1 Вас, зиЬНВБ ь М~М%\МУМ~~.~~.6~ЮЮЬ.Ж/ ~УЮЫЪ 3' / цу. цыц ' ц он ~ — д у / / I Рнс. 32.9 Смещение разрыва ведет к замещению части предсуществующей пепи дуплексной ДНК на вновь синтезированный материал. Рис. 323й Бактернальные ДНК-полимеразы проверяют правильность подбора пары оснований в конце растущей пепи и в случае ошибки вырезают добавленный нуклеотид.
стимулируется факторами 1 н П Е. сой (субъеднннцы ()бу), что свидетельствует о существовании сходства в разделении функций репликационных аппаратов двух бактерий. Уровень ДНК-полимеразы и зависит от физиологического состояния: она отсутствует в покоящихся спорах и появляется примерно через 30 мнн после начала прорастания. Некоторые фаги также копируют ДНК-полимеразы. Среди ннх такие, как Т4, Т5, Т7 н БРОК Все ферменты обладают как 5' — Зчсннтезирующей, так н 3' — 5'-экзонуклеолитической активностями. В каждом случае мутация в гене, кодирующем один фаговый полнпептид, предотвращает развитие фага.
Каждый фаговый полнмеразный полипептнд связан с другими белками, имеющими фаговое нли бактериальное происхождение, Реплнкацнонные системы фагов Т4 и Т7 обсуждаются в гл. 33. Синтез ДНК является полунепрерывным В связи с антипараллельной структурой двух цепей дуплексной ДНК возникает проблема нх реплнкацин. Прн движении реплнкационной вилки дочерние депи должны синтезироваться на обеих родительских цепях.
Вилка перемещается в направлении от 5'- к 3'-концу на одной цепи и от 3'- к 5'-концу на другой. Однако иуклеиновые кислоты синтезируются только в направлении от 5'- к Зчконцу, Противоречие разрешается благодаря тому, что цепь в действительности синтезируется в виде коротких фрагментов с обычной 5'- 3'-полярностью.
Их последук>щее объединение приводит к росту цепи в 3'-а — 5'-направлении. 4! 7 32. Топология репликации ДНК Рис. 32.10. Ведущая цепь синтезируется непрерывной, в то время квк отстающая цепь синтезируется в виде фрагментов. з' Длл того чтобы оинтезировалон следующий фрагмент, должна быть открыта одноцелочечнал область Пооледний фрагмент отстающей цели должен бьль оинтезирован Предшеотвующий фрагмент отетиощей цели — — — + дик ! ! ! оттР стор 0ТМР оППР Оптраза Путь иолользоеанил тимина 27- 1 !02 Рассмо~рим область, находящуюся рядом с репликацнонной вилкой (рис. 32.10). Если молекула ДНК раскручена, то на одной цепи синтез может идти непрерывно в направлении 5'-+ 3'.
Эта цепь получила название ведущей. Однако на другой цепи участок одноцепочечной родительской ДНК должен быть раскрыт, и тогда на нем синтезируется сегмент ДНК в направлении, обратном движению репликационной вилки. Эта цепь получила название отстающей. В направлении 5' — 3' синтезируется серия таких фрагментов, которые затем соединяются, образуя интактную отстающую цепь. Такой способ синтеза назван прерывистой репликацией. Прерывистая реплнкация изучена путем прослеживания за судьбой вновь синтезированной ДНК, получившей очень короткую метку радиоактивности.
Метка поступает во вновь синтезируемую ДНК, имеющую вид коротких фрагментов, седиментирующнх в пределах 7-11$, что приблизительно соответствует последовательностям длиной 1000 — 2000 оснований. Такие фрагменты были названы фрагмептамн Оказаки, Они обнаружены во всех реплицирующихся ДНК, как прокариот, так и эукариот. При более длительной инкубации метка входит в большие по длине сегменты ДНК. Они образуются в результате ковалентного связывания фрагментов Оказаки. Отстающая цепь должна синтезироваться в форме фрагментов Оказаки.
Довольно продолжительное время велась полемика относительно того, синтезируется ли ведущая цепь таким же способом или ее синтез идет непрерывно. У Е. сой вся вновь синтезированная ДНК существует в виде коротких фрагментов. На модели фага Т4 было показано, что обе цепи представлены в виде фрагментов Оказаки. На первый взгляд это свидетельствует о прерывистом синтезе обеих цепей. Однако оказалось, что не все фрагменты являются истинными фрагментами Оказаки; многие из ннх псевдофрагменты, образуемые при разрывах цепи ДНК, которая на самом деле синтезирована как непрерывная цепь. Причиной таких разрывов служит введение в ДНК урацила вместо тимина. Сначала полагали, что такое неправилыюе включение происходит редко. Но сейчас известно, что ДНК-полимсраза 1П Е. со!! не способна точно различать сП)ТР и с(ТТР ш у!!го и, по-видимому, ш у!ус.
На рис. 32.11 представлена схема пути биосинтеза сП)ТР и т)ТТР. Примерно 75% с(НТР образуется путем дезаминирования с(СТР, остальное — при фосфорилнровании сП)ТР. С помощью фермента сП)ТРазы Л)ТР превращается в с(ОМР (который образуется и путем дезами- нироваттия т)СМР).
сП)МР представляет собой промежуточное соединение, используемое для синтеза с)ТМР, необходимого для образования т)ТТР, предшественника в синтезе ДНК. Прн нормальных условиях соотношение тП)ТР и с(ТТР в Е сп!! составляет примерно 1:300. Если сП)ТР и ЙТТР не различаются ферментом, то на каждые 1200 оснований вновь синтезированной ДНК будет происходить включение примерно одного остатка урацнла. Он удаляется ферментом урацил-ДНК-гликозидазой, который играет важную роль, защищая ДНК от мутаций и от ошибок репликации. Активность урацил-ДНК-гликозидазы была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. Вероятно, существует унифицированная система защиты ДНК от присутствия урацила.
Удаление урацила происходит путем отщепления этого основании от сахара. При этом в фосфодиэфирную связь вводится разрыв. Он может быть превращен в пробел в результате удаления других нуклеотидов. Такие пробелы застраиваются синтезирующейся ДНК, замещающей утраченный материал. Серия таких событий показана на рис. 32.12. В течение периода времени между появлением и застройкой пробела разрывы во вновь синтезируемой ДНК вызывают образование фрагментов, сравнимых по размеру с фрагментами Оказаки. (Подобные события приводят также к уменьшению размера фрагментов Оказаки отстающей цепи.) Роль двух ферментов, урацил-ДНК-гликозидазы и с(ПТРазы, выявлена при изучении эффектов мутаций Рис. 32.! !. Синтез Ж/ТР и ЙТТР связан.
Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений 418 н. гасо нуклаотидов присутствует примерно один остаток ураципа При удалении урацила образуатоя пробал Пробелы, возникшиа при удалании урацила и пРобелы между фРагментами Окаааки, ааотраивамтол Ряс. 3232. Вырезание урацила яз вновь синтезированной дНК велет к образованию пробелов как в непрерывно синтезнруемой ведущей пепи, так н во фрагментах Окязакн отстающей цепи. в генах, кодирующих эти ферменты. Выщепленне урацила предотвращается в мутантах ицд, утративших глйкозилазный фермент. У таких мутантов примерно половина радиоактивной метки появляется во вновь синтезированной ДНК в форме истпнных фрагментов Оказаки; другая половина включается в значительно большие по размеру фрагменты. Отсюда следует, что ведущая цепь синтезируется непрерывно.
Клеточный баланс между дг)ТР и с)ТТР в большой степени зависну от активности тП3ТРазы, поскольку она одновременно служит как для удаления тт11ТР, так и для увеличении эффективности пути, ведущего к синтезу г)ТТР. Фермент с))3ТРаза неактивен в мутантах Е. сой г)из 1называемых также зо) ).
Его отсутствие приводит к значительному увеличению количества г)ПТР за счет ЙТТР, в результате чего мутантные клетки накапливают мелкие фрагменты вновь синтезированной ДНК. Таким образом, в клетках Е. сой отстающая цепь синтезируется прерывисто, а ведущая — непрерывно. По-видимому, то же самос происходит в других системах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
