Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 182
Текст из файла (страница 182)
15). Формально эта модель равнозначна постулированию присутствия в клетке репрессора, который подавляе~ функционирование вновь введенной ДНК, аналогично репрессору фага лямбда (гл. !6), Вместо белка-репрессора„ который связывает новую ДНК, РНК связывает вновь синтезированный предшественник РНК-затравки. Способность РНК 1 подавлять инициацию репликации может быть частью цикла негативного контроля, с помощью которого несовместимость связана с контролем числа копий. Однако мы еще не знаем роли этих 9обгятий в поддержании характерного числа копий Со!Е! ДНК (примерно 20 на 1 клетку), Возможно, она определяется соотношением между частотой инициации РНК-затравки и способностью затравки «запускать» синтез ДНК.
Этот тип несовместимости может быть следствием событий, используемых для регуляции репликации. Вполне вероятно также, что несовместимость является результатом механизмов, с помощью которых при делении плазмиды распределяются между дочерними клетками. В составе плазмиды рбС!0! имеется область размером 370 п.н., получившая название рог, которая необходима для распределения реплицировавшихся плазмид между дочерними клетками. Известно, что эта область не кодирует белок, активна в цис-положении и состоит из трех дискретных сегментов.
Центральная последовательность способна образовывать шпилечную структуру при спаривании оснований с любой из фланкирующих последовательностей этой же цепи. Делстирование любого из этих сегментов ведет к нарушению распределения копий плазмид. В противоположность этому у профага Р! функция рог связана с кодированием белка, узнающего иис-активный сайт, названный !псВ.
Мутации несовместимости картируются именно в этом покусе. Роль цис-активных сайтов распределения эквивалентна роли эукариотических центромер. Эти сайты обеспечивают прикрепление ДНК к клеточным структурами. Повидимому, несовместимость обусловлена конкуренцией за сайты прикрепления. Связь между распределением и клеточным делением может осуществляться специфическими белками. Рекомендуемая литература Обзоры, посвященные бактериальным и эукариотическим репликам, можно найти в книгах Льюина (Ьезе!и, Оепе Ехргезз)оп, 1„Вас!сна! Оепошез, Ецсагуойс СЬгогпозошез, %11еу, )ь(етч 'г'огК, 1974, !980), О выделении точек начала репликации ДНК бактерий и фатов сообщают ясуда и Хирота (уазЫа, Н!го!а, Ргос.
)ь)а1, Асаг). Вой (38А, 74, 5458 — 5462, 1977), Зискинд и Смит (Ууз/с1Ы, 5ппГ)з, Ргос, )ь)а!. Асаг!. Бс(. ОБА., 77, 2460 — 2464, 1980) и Гроссчедл и Хобом (бгокзсЬеп(, НоЬот )ь)а!пге, 2(зе, 39-43, 1979). Ласки и Харланд (7 азйеу, Наг!опт(, Се!1, 24, 283 — 284, !981) обсуждают структуру точки начала репликации ДНК эукариот. Митохондриальной ДНК посвятил свой обзор Клейтон (С)аутов, Се!1, 28, 693 — 705, 1982), Томизава и Ито описали систему Со!Е! (Топз(газка, !го)з, Ргос. )ь)а!. Асае!. 8с). ОВА, 78, 6096-6100, 1981). 32. Топология репликации ДНК Глава 32 ТОПОЛОГИЯ РЕПЛИНАЦИИ ДНК 409 Топологические перестройки ДНК играют важную роль в проявлении ее функциональных активностей (репликации и транскрипции), а также в организации структуры более высокого порядка. Исходное описание ДНК как двухцепочечной спиральной молекулы предусматривало, что ее синтез включает разделение родительских цепей.
Это предположение получило экспериментальное подтверждение, после того как был доказан полуконсервативный способ репликации ДНК (гл. 31). Цепи способны разделяться при поглощении энергии, достаточной для разрыва нековалентных связей, стабилизирующих двойную спираль. Следует учесть, однако, что цепи не просто лежат рядом друг с другом; они взаимозакручены, поэтому для их разделения необходимо вращение. Некоторые возможные способы раскручивания показаны иа рис.
32.1. Рассмотрим структуру ДНК, исходя из предположсния, что ее молекула имеет свободный конец, который позволяе~ цепям вращаться вокруг оси для раскручивания (рис. 32.1,А). При данной длине спирали, однако, это привело бы разделяющиеся цепи к значительному количеству вращений, которое, по-видимому, невозможно в условиях клетки. Аналогичный результат был бы получен прн наличии в области свободного конца специального механизма, контролирующего вращение (рис. 32.1, Б).
Во вращение должен вовлекаться непомерно большой по длине материал, поскольку эффект необходимо передать на значительное расстояние. К тому же следует помнить, что репликация превращает каждую из отдельных вращающихся цепей в дочерний дуплекс, имеющий еще более громоздкую структуру. ДНК ведет себя как замкнутая структура, утратившая свободные концы (гл.
28). Установление этого факта опровергло предложенные модели и со всей серьезностью поставило проблему топологии ДНК. Рассмотрим эффекты разделения двух цепей в молекуле, концы которой не способны свободно вращаться (рис. 32.1,В). Если две взаимоскрученные цепи разделяются в одном конце, это приводит к увеличению их взаимозакрученности дальше по длине молекулы. Следовательно, само по себе движение репликационной вилки увеличивает положительное суперскручивание впереди иее и делает дальнейшее продвижение репликационной вилки невозможным. Проблема может быть решена введением временного одноцепочечного разрыва. Схема, представленная на рис. 32.1, Г, показывает, что наличие внутреннего свободного конца дает возможность разрезанной цепи вращаться вокруг интактной цепи, после чего разрез должен быть ликвидирован.
Реакция разрезания и сшивки может повторяться по мере продвижения репликационной вилки. Такие реакции имеют место в случае использования в качестве субстратов замкнутых молекул ДНК. Они осуществляются с помощью ферментов, получивших название топоизомераз. Их действие при репликацни (а также транскрипции, см, гл, 11) является решающим. Ферменты, способные синтезировать новые цепи ДНК на матричной цепи, называют ДНК-полимеразами. Как прокариотические, так и эукариотические клетки имеют несколько полимеразных активностей. Но только одинединственный фермент обладает функцией репликазы в бактериальном или эукариотнческом ядре.
Другие выполняют вспомогательную роль в репликации и (илн) участвук>т в репарирующем синтезе ДНК при замещении поврежденных последовательностей (гл. 34). Принято думать, что ДНК-полимеразы обладают ДНК-синтезирующей активностью; однако вопрос о том, существует ли в виде дискретной единицы фермент ДНК- репликаза, остается спорным. (Мы уже обсуждали в главах 10 и 13 подобный вопрос в отношении РНК-полимеразы.) У бактерий может быть идентифицирован комплекс с активностью ДНК-репликазы, но он выделяется в виде отдельных (перекрывающихся) агрегатов из различных субъединиц. Не ясно, какая из них может рассматриваться как компонент самой репликазы, а какая служит вспомогательным фактором, необходимым для нормальной работы этого фермента.
В процессе нормальной репликации ДНК-синтезирующая активность представляет только одну из нескольких взаимссвя- Рлс. 32!. Разделение цепей дуплексной ДНК может осущест- влятьсл посредством одного пз указанных механизмов. ж Врященпе вокруг сппбоднпга хонда. Б. Аппарат, удерживающий цепи, яо врпмя ярпщпппя. В. Компенспруюп>яя положительная суппрсппряляза- цпя я другой аблясгп. Г. Разрезание, ярящппяе и воссоединение.
410 Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений занных функций. Вероятно, необоснованно считать ее отдельной функцией только потому, что мы можем выделить соответствующую ей ступень в общем процессе. Еще не открыта ДНК-полимеразная активность, которая способна инициировать синтез дезокснрибоцуклеотидной цепи.
Все известные ферменты удлиняют ранее начатые цепи. Следовательно, необходимым звеном аппарата репликации является обеспечение затравочной активности, которая способна запустить синтез цепи ДНК. Эта стадия обычно включает синтез короткой рибонуклеотидной последовательности, которая позднее удаляется. Описание топологии ДНК До сих пор мы имели дело с организацией двухцепочечной ДНК в пространстве, имея в виду плотность суперспирализации, или число суперспиральных витков, приходящихся на один виток спирали. Суперспиральный виток образуется, когда двухцепочечная ДНК делает один оборот около своей оси в пространстве либо в том же направлении, в котором закручена сама двойная спираль (положительная суперспирализация), либо в противоположном направлении (отрицательная суперспирализация). Положительная суперспирализация «перекручивает» двойную спираль, отрицательная суперспирализация «недокручивает» ее (гл.
2). После того как было введено понятие суперспирализации, для описания такого состояния приняли новую номенклатуру. В ее основе лежит понятие о числе зацеплений, которое определяе~, сколько раз две цепи замкнутой молекулы пересекают лруг друга в пространстве. Следовательно, число зацеплений равно числу оборотов, которое одна цепь ДНК делает вокруг другой, если молекула ДНК расправлена (гипотетически) в одной плоскости. Принято определять число зацеплений в значениях числа правосторонних пересечений над левосторонними, поэтому для правозакрученной спирали указанная величина всегда положительна и выражается целым числом.
Число зацеплений включает два компонента„Т (гжиг) и % (жг(гйе), определяемые уравнением Ь =%+ Т. Т (число оборотов) характеризует молекулу ДНК, а именно степень закрученности одной ее цепи вокруг другой. Т определяется числом пар оснований на виток. Для релаксированной замкнутой кольцевой ДНК, расправленной в одной плоскости, Т соответствует отношению общего числа пар оснований к числу пар оснований в витке.
Следовательно, Т вЂ э число витков в спирали. % характеризует число оборотов оси спирали в пространстве. Для релаксированной молекулы % = О. В этом случае число зацеплений равно числу оборотов одной цепи вокруг другой (Ь = Т). Параметр, измеряемый в определенных экспериментах, отражает изменение в числе зацеплений, Я.. Величина этого параметра определяется уравнением ГзЬ = Л'1т' + бт. Из него следует, что любое изменение в общем числе оборотов одной цепи ДНК вокруг другой складывается из изменений закрученности молекулы в пространстве (Л%) и измснений взаимозакрученности самой спирали (ЛТ). Пользуясь терминологией нашего предыдущего обсуждения, можно сказать, что Л% аналогично изменению в су- перспирализации, а АТ характеризует недокручивание или перекручивание ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
