Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 178
Текст из файла (страница 178)
Из этого следует, что истинные плазмидные зочки начала, по-видимому, отличаются от точки начала репликации хромосомы.) Выделенный фрагмент ДНК, несущий точку начала репликации, можно использовать для исследования отдельных функций репликации, 7аких, как акт инициации репликацни, контроль частоты событий инициации и сегрегация реплнцнрованных хромосом в дочерние клетки.
Выделение мутантов, дефектных по любой из этих функций, дает возможность идентифицировать последовательное'и, контролирующие каждое репликационное событие. Плазмиды, несущие в своем составе последовательность оНС, сегрегируют неправильно; для их стабилизации необходимо введение дополнительных последовательностей. Такой результат позволяет сделать два вывода: сама точка начала репликации не несет информации, требуемой для распределения дуплнцированных хромосом между дочерними клетками; функции, необходимые для правильной сегрегации можно идентифицировать при выявлении последовательностей, которые придают плазмиде сегрегационную стабильность. Путем уменьшения размера клонированного фрагмента удалось установить, что функциональная область оПС содержит только 422 пары оснований.
Наличие такого фраг мента в плаз миде гарантирует се выживаемость. Следует отметить, однако, что число копий таких плазмид в клетке может достигать 20. Следовательно, они угратили некоторые свойства, которые ограничивают часзоту инициационных собьпий. По-видимому, число копий и акт инипиации репликации могут зависеть от различных последовательностей. Точка начала репликации бактерии Яа!»тоне!)а Гурй(- »пег(ппс была локализована во фрагменте из 296 пар оснований. Сравнение с Е.
сой показало, что 86% оснований в этих областях совпадают. Рассматривая последовательность одной цепи, можно предположить, что образование вторичной структуры, напоминающей клеверный лист, происходиз так, как это показано на рис. 31.8. О потенциальном значении указанной структуры свидетельствует тот факт, что почти все 42 основания, которыми отличаю.гся эти районы у Е. сой и 5. 7урй!гнигпцтп, попадают в неспаренные области.
Весьма вероятно поэтому, что ДНК участка начала репликации имеет не правильную двухцепочечную структуру, а такую вторичную сзруктуру, когда каждая цепь напоминает клеверный лист, Для некоторых лямбдоидных фагов (один из которых лямбда) была также определена нуклеотидная последовательность участков начала репликации. Оказалось, что они родственны между собой, однако отличаются от соответствующей области бактериальной ДНК. Теоретически фаговые области начала реплнкации способны образовывать «клеверные листы» (с более тесно расположенными ответвлениями). Как показано на рис.
31.8, консервативная последовательность находится справа от потенциального места этой структуры, Такая последовательность присутствует в ДНК Е. сой, лямбда и другого фага, О4. Если допустить, что именно консервативные последовательности выполняю.г функции участков начала репликации, то следует отметить их вторичную структуру, которая скорее всего узнается именно благодаря своей структуре, а нс нуклеотидной последовательности. Маловероятно, что нарушение структуры ДНК,необходимое для образования «клеверного листа», происходит спонтанно, поскольку такая форма существенно менее стабильна, чем обычная двухцепочечная ДНК.
Ее появлению могут способствовать посторонние факторы, такие, как напряжение ог суперспирализации и стабилизация белками. Если вся эта последовательность ДНК действительно необходима для выполнения функции начала репликапии, то се с уверенностью можно назвать самым большим цис-действующим сайтом среди когда-либо найденных. (Двухцепочечные последовательности промоторов и операторов намного короче.) Согласованность процессов репликации ДНК и клеточного деления Ре7ьтикация и клеточный рост у бактерий тесно связаны. Частота инициации циклов репликации определяе7.- ся скоростью роста клетки.
И завершение цикла репликации согласовано с делением клетки на две, в процессе которого дочерние хромосомы се1регируют. Клетки Е. сой способны расти с различными скоростями; время удвоения варьирует от ! 8 до более чем 180 мин. Так как бактериальная хромосома представляет собой один репликоп, частота репликационных циклов контролируется числом событий инициации в единственной точке начала репликации.
Скорость синтеза ДНК при постоянной температуре более или менее постоянна. Рспликация происходит с одинаковой скоростью до тех пор, пока не наблюдается ограничений в снабжении предшественниками. Цикл репликации Е, гой может быть определен в значениях двух констант. О соответствует промежутку времени (примерно 20 мин) между завершением раунда репликации и клеточным делением, с которым она связана. Вероятно, этот период необходим для получения компонентов, принимающих участие в делении. С представляет Часть 1Х. Сохранение ДНК в ряду поколений Сот " "6 тосдддо'ч' А 6 А С д то', д т г А 6 д.,д С 6 6 дт д тд СО Дгдо СС албуу,' АГ 66 '6:,О,я': АТ6 тд тд 'Яф, А т д г гй))Т;1 6С ОС ТС Ж4'.
гд д СС дуй)лц) тд СА Огт Сд тОСССЧ»дСТСдддддстоддСддСОГттдттот СС!ТСТ ТОАСАО ст ОАА ОтОАсООС,тОАОТТТТТОАСтТОттоссААтдАОА сОААОАдстптс Тд ОС дт сп дт тд тд АТ Ат СО ОС ДС МГ,' ТА дт сс тд АТ ТА А т сд фйьз ОА А А Тд гл«ХУ А С ТА Ат 6'" С Т 6 О А Т С 6 ДОД Т С 20 При делении (35/О мин) клетка получает частично реплицированную хромосому. Репликационная вилка продолжает двигаться. Через 1О мин, когда «старая» репликационная вилка еще не достигла терминатора, в обеих точках начала репликации частично реплицированной хромосомы происходит инициация репликации. Начало движения этих «новых» репликационных вилок создает хромосому со многими вилками. Через 15 мин, т.е.
за 20 мни до следующего деления, старая репликационная вилка достигает терминаторной точки. Две дочерние хромосомы разделяются. Каждая из них уже часпгчно реплицирована с помощью новых репликационных вилок (теперь это единственные репликационные вилки). Эти вилки продолжают двигаться. В кочке деления две частично реплнцированные хромосомы сегрегируют. В результате восстанавливается то состояние, которое было вначале. Одна репликационная вилка становится «старой», она достигает точки терминации через 14 мин, а спустя 20 мин происходит деление.
Мы видим, что событие инициации происходит перед событием деления, с которым оно связано, за период, соответствующий 1зз/35 клеточных циклов. Основной принцип связи между инициацией и ци- 4;.::;::.;;;, т С т А Т т ;ю~-" 'мбйхйу ,.-$ собой фиксированное время, равное примерно 40 мин, которое необходимо для репликации всей бактериальной хромосомы. Продолжительность этого периода соответствует скорости движения отдельной репликационной вилки с присоединением около 50 тыс. пар оснований в одну мин. (Константы С и О отражают максимальную скорость, с которой бактерия способна расти; они примснимы ко всем значениям скорости роста, соотнетствующнм времени удвоения от 18 до 60 мин.
однако обе константные фазы становятся длиннее, если клеточный цикл длится более 60 мин.) Цикл репликации хромосомы должен инициироваться в фиксированное время, С+ Р = 60 мин, перед клеточным делением. Если бактерии делятся более часто, чем в 60-минутные интервалы, репликация у них должна инициироваться до окончания предыдущего цикла деления. Рассмотрим пример с клетками, делящимися каждые 35 мин.
Цикл репликации, связанный с делением, должен инициироваться на 25 мин раньше предшествующего леления. Такая ситуация изображена на рис. 31.9, показывающем состояние хромосом в бактериальной клетке через каждые пять минут клеточного цикла. Рнс 3!.8. Точка начала реплнхацнн у Е. сой имеет палнндромные последовательности, способные формировать сложную вторичную структуру. Красным цееюм обозначены основан«я, огхнчаююнеся у Я гудл1минцяд серые участки соответствуют аенаванцям, нцентнчным у фага лвмода. Точка кечаяа Концевая точка эв б / 1 1 Инициация 1 l +в Рнс.
31тх Постоянный интервал бб мнн между инициа- цией реплнкацнн н клеточным делением ведет в быстро растущих клетках к образованию хромосомы со многими вилками. 31. Репликон: единица репликацни 401 клом клеточного деления сводится к следующему: чем быстрее растут клетки (чем короче цикл), тем большее количество циклов перед соответствующим делением отделяет событие инициации. Соответственно существует большее число хромосом в отдельной бактериальной клетке.
Такая взаимосвязь может рассматриваться как ответ клетки на ее неспособность завершать периоды С н О более быстро в соответствии с более коротким циклом. Как узнает клетка, когда именно следует инициировать цикл репликации? Событие инициации происходит при постоянном соотношении клеточной массы н числа точек начала репликацин. Клетки, растущие быстрее, имеют большую массу и поэтому обладают большим числом точек начала репликации. Как показано на рис. 31.9, в точке, соответствующей 1О мин после деления, клеточная масса увеличена достаточно, для того чтобы поддержать событие инициации в обеих доступных точках начала реплнкации.
Для объяснения зависимости инициации репликации от клеточной массы были предложены две модели. Одна нз них предполагает непрерывный синтез белка-инициатора в течение клеточного цикла. Накопление критического количества такого белка может служнть сигналом для инициации. В соответствии со второй моделью в определенном периоде цикла в клетке синтезируется белок-ингибитор, а при увеличении объема клетки его уровень падает ниже эффективного. Существуют данныс, свидетельствующие о том, что инициация действительно регулируется клеточной массой. Однако пока не установлено, происходит лн это в результате накопления инициатора или разведения ингибнтора.
В настоящее время предпочтение отдается модели, предполагающей синтез инициатора, поскольку она согласуется с данными, свидетельствующими о том, что для события инициации требуется синтез белка. Инициация циклов репликации может быть нарушена мутациями в нескольких генах Е. со1т; существует также множество генов, продукты которых необходимы для клеточного деления. Однако белки, ответственные за контроль частоты инициации или за связь репликации с циклом деления, при анализе этих мутаций еше не идентифицированы.
Независимо от того, какой тнп регуляции используется, рост бактерии может быть описан в значениях клеточных единиц, имеюшнх длину 1,7 мкм. Бактерия содержит одну точку начала репликацни на клеточную единицу; быстро растущая клетка с двумя точками начала репликацин должна иметь длину более 3,4 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
