Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 174
Текст из файла (страница 174)
Однако предпо- ложение об общей регуляторной роли метилирования в генной экспрессии имеет свои слабые стороны. Так, например, в случае )з, те(аиодажег (и других двукрылых насекомых) не обнаружено метилирования ДНК. Между тем другие различия между активным и неактивным хроматином у этих организмов такие же, как и у видов, которым свойственно метилирование.
Таким образом, у Пгозор(т((а метилирование либо не нужно, либо оно заменено каким-то другим механизмом. Сайты, сверхчувствительные к ДНКавс, расположены перед активными промоторами Первый эффект, наблюдаемый при расщеплении хроматина очень низкой концентрацией ДНКазы,— зто индукция разрывов в двухцепочечной ДНК в специфических сайтах. В случае целого генома, например у П. ще!аиодавгег, в результате воздействия образуется серия специфических фрагментов, варьирующих в размере от 2 до 20 т.п.н.
Эти фрагменты соответствуют участкам ДНК, расположенным между сверхчувствительными сайтами. Такие фрагменты не образуются при расщеплении свободной ДНК; они возникают (тканеспецнфично) при расщеплении хроматиновой структуры. Где локализованы этн сверхчувствительные сайты? Их положение можно установить для индивидуальных покусов, используя метод непрямого концевого мечения, о котором мы говорили ранее в связи с фазированием нуклеосом.
Схема опыта воспроизведена на рис. 30.16. Хроматин расщепляют ДНКазой 1, ДНК выделяют н затем расщепляют рестриктирующим ферментом. Смесь, полученную после двойного гидролиза, подвергают электрофорезу и гибридизуют с зондом, который соответствует участку, расположенному рядом с сайтом рестрикции. ДНКаза 1 делает разрез в определенном сайте, 30. Нуклеосомы в активном хроматине 389 образуя дискретный фрагмент, размер которого указывает расстояние между сверхчувствительным сайтом и сайтом рестрикции. Многие сверхчувствительные сайты связаны с экспрессией генов.
Каждый активный ген имеет один или (иногда) более сайтов разрезания, расположенных в участке, непосредственно прилегающем к промотору со стороны, противоположной направлению транскрипции (с 5'-конца). Некоторые примеры локализации сверхчувствительных сайтов суммированы на рис. 30Д?. 5'-Сайт разрезания обнаруживается июлько в хроматиие клеток с экспрессирующими генами. В неактивных генах он не обнаруживается. Например, у глобиновых генов сверхчувствительные сайты расположены в 5'-направлении от генов эмбрионального глобина в эмбриональных клетках, ио не во взрослых клетках, и наоборот.
Такие сайзы иногда могут различаться по чувствительности (судя по интенсивности соответствующих полос). При близком расположении множественных сайтов некоторые из иих оказываются значительно чувствительнее других. Помимо этих сайтов могут быть обнаружены сайты в других местах, в пределах транскрибируемого гена или на некотором расстоянии от него по ходу транскрипции (в сторону 3ьконца).
Значение сайтов, расположенных в других местах, неясно. Корреляция между транскрипцией гена и сверхчувствительными сайтами, располагающимися в направлении 5'-концгь убедительно подтверждается данными, полученными при изучении гена 5дй4 О, ще)аподагнег, кодируюшего клейкий белок слюнных желез, В этой ткани в данном гене существуют два особенно сверхчувствительных сайта, лежащие на расстоянии 330 и 405 п. н. от 5чконца гена.
В мутантной линии мух есть делеция протяженностью !00 п.нн захватывающая оба сверхчувствительных сайта. Несмотря иа то что еще остался отрезок более 250 п, н. «выше» стартовой точки транскрипции, у этого мутанта ие образуется клейкого белка. Исходя из этих результатов, можно предположить, что удаление сверхчувствительного сайта нарушает актнвадию гена. Присутствие сверхчувствительного сайта хотя и необходимо, но недостаточно для того, чтобы обеспечить транскрипцию. В естественных условиях трудно установить, через какое время после появления сверхчувствизельных сайтов начинается транскрипция, поскольку нелегко получить клетки, находящиеся иа одной и той же стадии развития.
Однако это можно выполнить на определенных клетках эризроидного ряда курицы, иммортализованных в культуре с помощью РНК-содержащего опухолеродного вируса. Различные клеточные линии представляют разные стадии эритропоеза. В одной из таких линий уже имеются сверхчувствительные к ДНКазе сайты, но еще не начата транскрипция глобинового гена. Эта линия, возможно, захвачена на стадии между активацией сверхчувсз.вительвого сайза и началом генной экспрессии. Все указания, однако, свидетельствуют о том, что сверхчувствительный 5'-сайт (или сайты) появляется перед тем, как начинается транскрипция, и, очень возможно, служит предпосылкой инициации. Каким образом возникают сверхчувствительные сайты? Для анализа их структуры нужна система (п Игго.
Сверхчувствительная область гена взрослого б-глобина цьпьзенка была воссоздана на плазмиде. Когда цлазмида, несущая этот ген, соединялась с гистонами в присузствии экстракта из ядер эритроцитов, соответствующие участки Расмепленн крома ина Дн хазой ! Специфк еск й сайз Разрезании ЬякйжЯЯЯ ЯЫЕЯЯРЧЯРйРЗЯРЬЮМЬЪЯРЬР сару Расуоикции ЯЯЯЯЯДХзркрскййРУаЯЯЯяяяя Злекуройюрез Перенос у ующу фра е у.
Рззре о у а к на о с ои руюмнм Рпс. Зодб С помощью метода непрямого конпейого мечепия определяют расстояние от сайта сяерхчувствптельностя к ДНКйзе до сайтй рестрпкпиоипого расщепления. становились сверхчувствительными. Очистка активного фактора должна быть достаточно простой: для определения можно использовать саму способность образования сверхчувствительных участков. ЭкстРакт нс может пРидавать свеРхчУвствительностьн если его добавлять после гистонов.
Из этого следует, что соответствующий фактор в экстракте узнает ДНК непосредственно и каким-то образом меняет организацию данного участка. лишенного нуклеосом. По крайней мере, в этих условиях соответствующий компонент не может удалить нуклеосомы после того как они сформировались. Таким образом, мы возвращаемся обратно к исходному вопросу: каким образом изменяется структура хроматина, когда ген должен перейти в активное состояние? Стабильность сверхчувствительного сайта была выявлена при изучении свойств куриных фибробластов, трансформированных тсмпературочувствительными опухолеродными вирусами. В ззих опытах используется необычное явление: хотя фибробласты не относятся к клеткам эритроидной линии, трансформация этих клеток при нормальной температуре приводит к активации глобиновых генов. В активированных генах имеются сверхчувствительные сайты.
Если трансформацию проводят при более высокой (иепермиссивпой) температуре, ие происходит ии активации глобиновых генов, ни появления сверхчувствительных сайтов. В тех случаях, когда глобиновые гены быди активированы трансформацией при низкой температуре, их можно инактивировать повыше- Зчо Часть 7111. Упаковка ДНК 1 т.п.н. ° Я Э клон Ш Интран ) Фланкирующие области )и Направление транскрипции | Сверхоувствительнмй саит Рис.
30.! 7. Сверхчувствительные святы располагаются около 5ьконца активных генов, а [ннотда) также в других местах. Ркс. ЗОЛ 8. Сверхчувствительный свйт (Ьгло бинового гена курицы занимает Область чувствительную к нескольким нуклеазвм. нием температуры. Но сверхчувствительные сайты сохра- руемую область к ДНКазе 1; 3) недометилирование ДНК няются на протяжении по крайней мере 20 следун>щих в транскрибирусмой области. Все эти изменения мокнут клеточных делений. быть необходимы для транскрипции. Этот результат етпе раз показывает, что образование сверхчувствительного сайта-это лишь одно нз условий, необходимых для инициирования транскрипции. Из этого В сверхчувствительных участках следует, что события, связанные с образованием сверх- нет нуклеосом чувствительного сайта, отличаются от событий, связанных с его воспроцзведением в потомстве.
Однажды Какова природа сверхчувствительных сайтов? образованный сайт воспроизводится при репликапии Каждый из них представляет собой область размером в отсутствие условий, необходимых для его индукции. 100-200 п.н, доступ к которой не ограничивается ти- (Вероятно, поэтому требуется специфическое вмешатель- пичным для нуклеосом способом. Некоторые из этих сай- ство, для того чтобы удалить из молекулы сверхчув- тов изучены детально. ствительный сайт.) Сайт на 5ьконце ))-глобинового гена взрослого типа Каким образом сверхчувствительные (или другие) у курицы предпочтительно расщепляется несколькими сайты передаются следующему поколению прн реплика- ферментами, включая ДНКазу 1, ДНКазу 1! и нуклеазу цни ДНК'? Можно представить разнообразные меха- микрококков, На карте, изображенной на рис.
ЗОЛ8„по- низмы. Наследственное изменение может произойти казано, что сайты, предпочитаемые этими ферментами, в самой ДНК -например, деметилирование. В регулярной лежат довольно близко друг от друга в пределах одной двойной спирали может происходить структурное изме- области. пение (при участии белков, восстанавливающих структуру Рестриктируюший фермент Мзр! расщепляет два после каждой реплнкапии). Высококооперативные белки сайта этой области.
Часть фрагментов, образованных могут образовывать комплекс (с двухцепочечной ДНК), этим ферментом, оказывается в виде свободной ДНК. который способен распадаться на отдельные компоненты Таким образом, в период транскрипции область, распо- при реплнкации, а потом восстанавливаться (см. рис. 29.20), ложенная от — б0 до — 260, становится предпочтительно Мы рассмотрели трн изменения, обнаруженные в ак- чувствительной к нуклеазам.
тивных генах: 1) появление сверхчувствительнот.о сайта В сходных экспериментах показано, что 5'-сверхчувст- (сайтов) около промотора; 2) более высокая чувствитель- вительный сайт гена тнмидиц-киназы вируса герпеса за- ность нуклеосомного домена, включающего транскрнби- нимаст область от — 4 до — 182. Сайты-мишени этой Ген О аб а -ЗОΠ— 250 — 2ОО аье5. м 1! *1 1 и ро ок оа 30. Нуклеосомы в активном хроматине 391 рпо 3019 В мини-хромосоме вируса ВЧ40 может быть безиу- клеосомиый пробел. 1Фогография любезгго презгаегаалепа Мояйе хамуд области предпочтительно расщепляются рестриктируюшими фермен гами. ДНК сверхчувствительных сайтов активных генов глобина у кур расщепляюзся нуклеазой б1, субстратом которой служит одноцепочечная ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
