Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 169
Текст из файла (страница 169)
Следовательно, можно предположить, что образование нуклеосом ограничено таким способом, который позволяет им находиться только в немногих (2 — 4) альтернативных фазах. Интересная ситуация была обнаружена в некоторых генах тРНК у Хвпорив !аве(в. В хроматине эритроцитоц где гены не зкспрессируются, ДНК организована в нуклеосомы с длиной повтора 198 п.н. Большинство нуклеосом находится в одной фазе на протяжении по крайней мере 3 т.п.н. (внутри этого участка может быть отрезок в 250 п.н. без нуклеосом), Иная картина наблюдается в хроматипе клеток печени и почек, в которых происходит экспрессия генов з'РНК. Длина нуклеосомного повтора в этом случае составляет всего 185 п.н., и нуклеосомы не фазировапы.
Из этого следует, что размер нуклеосомного повтора и локализация нуклеосом могут, очевидно, изменяться в зависимости от обстоятельств. Фазированне нуклеосом может осуществляться одним из двух способов. Один из них заключается в том, что каждая нуклеосома располагается специфически на определенной последовательности ДНК, Это несколько противоречит представлению о том, что нуклеосомная субъединица может образоваться в результате соединения любой последовательности ДНК с гистоновым октамером.
Второй возможный способ связан с существованием некой специфической последовательности, которая предпочтительно участвует в образовании первой нуклеосомы на данном участке, а затем начинается последующее образование нуклеосом с определенным размером нуклеосомного повтора. (Если в конструкции нуклеосом существует некоторое разнообразие †наприм, если длина линкерного участка может варьировать, скажем, на 1О п.н., †мес специфической локализации будет постоянно смещаться по мере удаления от первой фиксированной нуклеосомы.) Стартовую точку образования нуклеосом можно определить путем связывания негистоновых белков со специфическим сайтом ДНК.
Несмотря на то что фазирование возле фиксированных сайтов может быть обусловлено пограничным эффектом, могут также существовать фазированные ряды нуклеосом. В качестве примера назовем а-сателлитпый хроматин африканской зеленой мартышки. Эта ДНК состоит из тандемно повторяющейся последовательности в 172 и.н. Длина повтора в нуклеосомах такая же, так что одна нуклеосома приходится на один сателлитный повтор. Широко распространенный негистоновый белок, называемый сс-белком, связывается преимущественно с и-ДНК, узнавая два типа коротких А- — Т-богатых по- следовачельносгей, Расположение этих последовательностей в повторяющейся единице сателлитной ДНК показано ца рис. 29.19.
Каждая повторяющаяся единица ДНК содержит одну копию первой последоватедьности (сайт 1) и две копии второй последовательности (сайты П и П1), находящиеся в противоположной ориентации. Инвертированные последовательности отстоят на 145 п.нл расстояние, равное длине ДНК, обмотанной вокруг гистоновой сердцевины. Другой сайт расположен посередине между ними. Нуклеосомы ц-сателлитной ДНК фазированы таким образом, что положение сайтов П и Ш приходится на концы ДНК минимальной нуклеосомы. Поскольку ДНК закручена вокруг гистонового октамера, сайт 1 находится в непосредственной близости от них. Таким образом, кластер сайтпв, свчзыванпних ц-белок, находится на одном и том жв участке поверхности нуклеосо,ны.
Исходя нз локализации этих сайтов связывания можно предположить, что з-белок отвечает за фазирование нуклеосом. Связываясь с регулярно расположенными сериями сайтов в ДНК, х-белок может обеспечивать сборку гистонов в октамеры нуклеосом, ДНК которых находится в определенной фазе. Этот механизм может использоваться для фазирования нуклеосом на протяженном участке, илн, действительно, для запуска образования серии нуклеосом, начиная с фиксированного положения.
Значение фазирования нуклеосом, даже если считать его доказанным в некоторых случаях, неясно. Одна из возможных причин кажущегося фазирования заключается в том, что существуют области, в которых нет нуклеосом. Такие области могут быть связаны с контролем экспрессии генов или же с образованием структур более высокого уровня организации хроматина. Вполне возможно, что область, лишенная нуклеосом, служит барьером, ограничивающим возможность образования следующей нуклеосомы в определенных положениях. В этом случае статистическое распределение нуклеосом буде~ таким же, как при фазировании, хотя отдельные места их расположения не обязательно должны быть фиксированы в каждой индивидуальной копии генома.
СПЕЦИфИЧЯОСТЬ НУКЛЕВЗЫ микрококков В пропессе обсуждения экспериментальных данных мы говорили о нуклеазе микрококков как о ферменте, который расщепляет ДНК в незащищенных линкерных участках независимо от их нуклеотидной последовательности. Вначале так действительно и считали. Однако с тех пор было выяснено, что фермент обладает некоторой специфичностью (склонен выбирать определенные А — Т-богатые последовательности). Таким образом, мы не можем считать, что наличие специфической полосы при использовании непрямого концевого мечения указывает расстояние от места рестрикционного расщепления до лицкерного участка.
На деле данная полоса может отражать расстояние от места рестрикционного расщепления до сайта предпочтительного расщепления нуклеазой микрококков) Возможность такой ситуации выяснена с помощью контрольного эксперимента, в котором очищенную ДНК обрабатывали точно так же, как и хроматин. Если в определенном участке имеются места предпочтительного действия для нуклеазы микрококков, то должны образовываться специфические полосы. Затем полученную картину 30. Нуклеосомы в активном хроматине 379 расположения полос сравнивали с той, которая получалась при обработке хроматина. Если расположение нуклеосом на ДНК происходит случайным образом, то все сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, рано или поздно окажутся в линкерной области, став доступными лля действия фермента, Картина расположения полос при расщеплении хроматииа н ДНК будет одинаковой. Но, если нуклеосомы лежат в упорядоченных местах (фазированы), некоторые сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, будут вне пределов досягаемости, так как окажутся в пределах минимальной нуклеосомы.
Тогда отдельные полосы, обнаруживаемые при электрофорезе расщепленной ДНК, будут отсутствовать в электрофореграммах расщепленного хроматина. Если же при образовании нуклеосом возникают новые чувствительные сайты, то в электрофореграммах расщепленноуо хроматина можно будет обнаружить новые полосы.
Таким образом, различие в расположении полос при расщеплении контрольной ДНК и хроматина доказывает существование фазирования нуклеосом. Такие эксперименты действительно были выполнены. Эти результаты проливаю~ некоторый снег на природу межнуклеосомного сайта, разрезаемого нуклеазой микрококков. Вероятно, фермент разрезает линкерную ДНК не в наиболее открытой точке, а в предпочтительном сайго, ближайшем к этому положению (если такой есть).
Поскольку положение таких сайтов может быть различным, ширина полос увеличивается. Способность сайтов предпочтительного расщепления привлекать к себе фермент, возможно, увеличивает количество положений в линкерной ДНК, наиболее доступных для нуклеазы микрококков. Сохраняют ли транскрибируемые гены нуклеосомную структуру? В процессе транскрипции локально расплетенный участок, образованный РНК-полимеразой, перемешается вдоль ДНК (как это описано в гл. !О). При этом обе комплементарные цепи ДНК непосредственно связаны с ферментом или даже окружены им, как это изображено на рис.
!0.3. Примерно 50 п.н. ДНК действительно связаны с ферментом настолько прочно, что даже защищены от действия нуклеаз. Поскольку ДНК должна быть расплетена, то кажется маловероятным, чтобы участок, связанный с РНК-полимеразой, мог оставаться на поверхности нуклеосом.
Однако о стереохимии работы РНК-полимеразы (особенно у эукариот) известно мало. Поэтому можно предполагать, что фермент способен использовать одну цепь ДНК в качестве затравки, тогда как другая цепь остается связанной с гистонами. Механизм, с помощью которого ДНК расплетается, образуя матричную цепь лля РНК-полимеразы, неясен. Обычно считают, что в этом процессе участвует что-то вроде шарнира, благодаря которому одна цепь ДНК может свободно вращаться относительно другой. Проблема раскручивания еще более'усложняется, если ДНК во время транскрипции неподвижно закреплена на нуклеосоме. При рассмотрении этих вопросов следует помнить об относительных размерах РНК-полимеразы и нуклеосомы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
