Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 165
Текст из файла (страница 165)
Однако способ укладки линкерной ДНК может быть иным. Анализ «лестницгз полученных при расщеплении ДНКазой 1 фразментов длиной более 1000 п.ни свидетельствует в пользу того, что выходящая из кора ДНК уложена так же, как и ДНК кора. Это означает, что одна и та же периодичность разрезания сохраняется не только в отдельной нуклеосоме, но и между нуклеосомами. Другими словами, ДНК следует от одной нуклеосомы к другой, не нарушая способа организации, по крайней мере насколько это видно из периодичности разрезания. ОРГаНИЗаЦИЯ ГИСтОНОВ И ДНК До сих пор мы рассматривали конструкцию нуклеосомы, исходя из того, как организованы повторяющиеся единицы длины ДНК на поверхности нуклеосом.
Если же исходить из организации белка в нуклеосоме, то нужно знать, каким образом гистоны взаимодействуют друг с другом н с ДНК. Взаимодействуют ли гистоны только в присутствии ДНК или способны независимо собираться в октамеры? Мы еще многого не знаем о структуре индивидуальных гистонов в нуклеосоме, но уже стала проясняться их относительная локализация. Большинство данных о взаимодействиях гистонов получено при нзуче- ( Н4) (нзв) ~~нз) ( .не — — Осейесйисй симметрии Рис.
29.17, Модель нуклеосомы спереди и сверху. Видна симметричность конструкции с сердцевиной из тетрамера НЗзН4з. нии способности к агрегированию н к образованию перекрестных спзивок в нуклеосоме. Способность гистонов агрегировать друг с другом изучена хорошо. Гистоны, богатые аргинином, можно получать в виде хороню различимого тетрамера (НЗзН4 ). Гистоны, умеренно богатые лизином, образуют продукт, который менее четко охарактеризован, но который, очевидно, образует димер (Н2А Н2В), имеющий тенденцию к дальнейшей агрегации. Одной из форм образующегося агрегата может быть тетрамер (Н2А,.Н2Вз). Два указанных тетрамера называют гомотипическнми (название отражает то, что каждый из них содержит только гистоны, относящиеся к одному из исходных классов).
Интактные октамеры гистонов можно получи~ь либо экстракцией хроматина, либо (с большими трудностями) путем соединения гистонов )п р(гго в условиях высокой концентрации соли и белка. Октамер может диссоциировать с образованием гексамера гистонов и свободного димера Н2А.Н2В. В результате отделения второго димера Н2А Н2В образуется тетрамер НЗзН4 .
Все эти формы можно эксграгировать из хроматина. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что в нуклеосоме имеется центральное «ядров ()гегпе!), состоящее из тетра- мера НЗ,Н4,, связанного с двумя независимыми димерами Н2А.Н2В. Перекрестные сшивки позволяют установить, какие пары гистонов лежат ближе друг к другу в нуклеосоме. (Сложность в интерпретации этих данных заключается в том, что ошивается только небольшая часть гистонов. Поэтому следует оценивать результаты с осторожностью, учитывая типичность болыпинства взаимодействий.) На основе полученных данных была сконструирована модель организации нуклеосомы. В достаточно схематичной форме она изображена на рис. 29Л7. Структурные исследования показывают, что по своей общей форме изолированный гистоновый октамер похож на минимальную нуклеосому.
Из этого следует, что общая структура зависит от гистон-гистоновых взаимодействий. Положение индивидуальных гнстонов в структуре октамера было установлено на основе их способности к агрегированию и к образованию поперечных сшивок. Диаметр всего октамера определяется размером тетрамера НЗзН4з. Этой особенностью объясняется способносзь тетрамера !и И!го организовывать ДНК в частицы, проявляющие некоторые свойства минимальной нуклеосомы (см. ниже).
Белки располагаются в тетрамере 29. Нуклеосомные частицы 369 н структура хроматина Ар иии — богатый гнем а й тетремер Н2А «2В днк 8 н2А.н2В днк Пап ый иста а й а«тамар Нукпеоеома Дапапнитепаный навар из четырех гиатоноп Папунукпеа- сомы Нукпеоеама 24 — 1 Ю2 Рнс. 29.1К В определенных условиях 1п п1го ДНК может связываться с тетрамером НЗ,Н4,, к которому присоединяются два днмера Н2А Н2В.
В других условиях ДНК может прямо взаимодействовать с ннтактным гнстоновым о«тамарам (содержащим перекрестные сшнвкн). так, что их порядок отвечает наблюдаемым поперечным сшивкам: НЗ-Н4 и НЗ-Н4. Пары Н2А Н2В присоединяются в виде двух димеров. ДНК дважды обматывается вокруг октамера. Гистон Н! может «запечатывать» ДНК в нуклеосоме, связывая ее в точке, где сближаются входящая и выходящая нити.
Этим обьясняется способность гнстона Н1 образовывать поперечные связи с гистоном НЗ. Описанная модель имев~ симметрию второго порядка. Несмотря на то что общая форма октамера теперь определена достаточно точно (хотя на рисунке этого не видно), индивидуальные гистоны изображены на рисунке в виде аморфных шариков, поскольку мы не располагаем данными об их структуре. Распределение аминокислот на )ч)-конце, несущем большой заряд, одинаково у всех гистонов. Остальная часть молекулы содержит гидрофобные аминокислоты, которые, вероятно, образуют глобулярную структуру и участвуют в белок-белковых взаимодействиях. По этой причине гистоны иногда воспринимаются как глобулярные белки с заряженными Х- концевыми «хвостами», Можно было бы думать, что у «хвостов» преобладает ДНК-связывающая активность, тогда как глобулярные области входят внутрь сердцевины.
Однако против этой модели свидетельствуют данные о том, что Х-концевые области можно отщепить (обработав трипсином) от гистонов сердцевины, не вызывая при этом сколько-нибудь существенных нарушений структуры нуклеосомы. Кроме того, гистоны без Х-концевых «хвостов» могут участвовать в сборке нуклеосомы 1и тйгго. В настоящий момент мы не можем приписать индивидуальных функций определенным участкам гистоновых молекул. Сборка нуклеосом и репродукция хроматина Гистоны сердцевины обладают способностью накручивать ДНК вокруг белкового октамера. Однако существует несколько способов, посредством которых ДНК может связаться с гистонами.
Первоначально реконструкцию нуклеосом тп упго можно было осуществить только в условиях, далеких от физиологических; отдельные компоненты смешивали при высокой концентрации солей и мочевины, которые потом удаляли с помощью лиализа. Но теперь реакцию частично контролируют, ре~улируя последовательность добавления пютонов и ДНК и их относительную концентрацию. В этом случае самосборка происходит в условиях, 'близких к физиологическим.
Процесс этот, медленный сам по себе, еще и ограничивается тенденцией собираюгцихся частиц к препнпитации. Два возможных способа сборки нуклеосом показаны на рис. 29.18. Один из них обусловлен способностью тетрамера НЗ Н4 организовывать ДНК в частицы, которые несколько напоминают минимальную нуклеосому (по их чувствительности к нуклеазе мнкрококков). При добавлении димера Н2А Н2В эти тельца могут превращаться в минимальную нукдеосому. Именно отсюда возникла идея о том, что в структуре нуклеосомы существует !!ядро» из аргинин-богатых гистонов. Возможно, такой путь используется (п у(уо, поскольку это согласуется с наблюдением, что гистоны НЗ и Н4 включаются в реплици- Рнс. 29.19.
Может лн нуклеосома разделяться на две нолуну- кпеосомы (тетеротнпнческне тетрамеры), которые могут стать полными нуклеосом»ми путем добавления второго гетерогнпн- ческого тетрамера гастонов? 370 Часть ЧН1. Упаковка ДНК Рис. 29.20. Существует мно- го возможных вариантов по- ведения нуклеосом прв реп- ликапии ДИК Г ) ! Ф Гистоновые октамеры сохраняются цепикам; расщеппяются случайно по дочерним цепям ДН К; должны быть добавлены новые октамеры остаются на одном дочернем дуплексе, тогда как «новые» октамеры собираются на другом.
Однако, если предотвращена сборка новых гистонов 1например, путем подавления синтеза белка циклогексимидом), «старые» октамеры разделяются между обоими дочерними дуплексами. Таким образом нуклеосомы могут образовываться двумя способами. При репликации хроматина уже находящиеся на нем гистоновые октамеры удаляются с ДНК, что делает возможным репдикацию.
Эти октамеры сохраняются и могут реассоциировать с любым из дочерних дуплексов. Однако такое же число октамеров должно быть образовано из новосинтезированных гистонов. Происходит ли сборка этих октамеров также раньше, чем они связываются с ДНК или же наоборот, в данном случае они собираются па ДНК? Или, может быть, октамеры распределяются случайно между дочерними дуплексами? Эксперименты, поставленные для выяснения этого вопроса, не дали однозначного ответа, поскольку трудно отличить заново реплицированный материал от массы пред- существовавшего хроматина. Очевидно, что в процессе редупликации хроматина ДНК не остается свободной от нуклеосом в течение сколько-нибудь продолжительного периода.
Как только ДНК реплицируется, нуклеосомы сразу образуются на обеих репликах независимо от того, каков точный механизм процесса. Это проиллюстрировано на электронной микрофотографии 1рие. 29.21), на которой показано, что у только что реплицированного отрезка ДНК оба дочерних дуплекса уже усыпаны нуклеосомами.
Структура участка, в котором непосредственно происходит репликация ДНК, отличается от других областей. Этот участок более устойчив к нуклеазе микрококков и прн ферментативном расщеплении образует полосы, отличающиеся по размеру от нуклеосомной ДНК. Следовательно, можно предположить, что в репликации ДНК участвует достаточно большой белковый комплекс, причем почти сразу после того, как он передвигается дальше, восстанавливается нуклеосомиая структура.