Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 164
Текст из файла (страница 164)
Из этого следуют два важных вывода, Во-первых, ДНК не защищена на нуклеосоме и остается чувствительной к ДНКазе !; оиа ие «покрытав белками. Во-вторых, чувствительные участки расположепы периодически. Не все участки разрезаются с одинаковой частотой: некоторые разрезаются достаточно эффективно, а другие совсем редко. Ферменты ДНКаза 1 и ДНКаза и образуют одинаковую лестницу, хотя с некоторыми различиями в интенсивности полос. Это говорит о том, что картина разрезания обусловлена уникальной серией мишеней в ДНК, определяемых ее организацией.
Отдельные ферменты имеют только слабое предпочтение к определенному сайту в этой мишени. Поскольку в минимальной нуклеосоме находятся две цепи ДНК, метка вводится в оба 5чконца (или Зчконца)ь так что метится один конец каждой цепи. Поэтому при разрезании образуются фрагменты, относящиеся к обеим цепям. Это изображено на рис. 29.12, где каждый фрагмент происходит из разных цепей. В таком эксперименте каждая меченая полоса в действительности представляет Збб Часть У111.
Упаковка ДНК /~~Щ~/~~~Я~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~йЯй~Я~~~~~Я~Я~~Я~Д~~~Я)Дк~~~ унвзвны — $12 - 911 — 810 $9 96 Дзнвтурнраввннвн дик Рис. 29.!1. Одцоцепочечные разрывы (ники) в двухцепочечной ДНК обнаружи- вают ио образованию фрагментов после денатурацин ДНК и образования отдельных цепей. Рззрз ° ° Ызыз нз нз Рюрнл Дена урзнн ~ з и зне (3 П я лл полн Эле зрлфлрзз — — — — — -й Рис. 29.!2. С помощью метода концевого меченая определяют расстояние от одноцепочечных разрывов до меченых концов.
Рис. 29.13. На электрофорезрамме ядерного гидролизата, образованного пол действием ДНКазы 1, видно, что сайты одноцепочечных разрывов располагаются на ДНК минимальной нуклеосомы через определенные интервалы. (Фптпграфнв любезно предоставлена Ьзппвтб 1 парт.! собой два фрагмента, отрезанные на одном и том же расстоянии от любого из меченых концов. Как же тогда можно объяснить дискретное предпочтение определенных сайтов? Обычная точка зрения заключается в том, что фермент действует симметрично на обе цепи. Таким образом, если, например после обработки ДНКазой 1 не образуется фрагмента в 80 п. нн это должно означать, что положение, соответствующее 80-му основанию с 5чконца любой из цепей, нечувствительно к ферменту.
Какова природа участков-мишеней? Первый вопрос, который нужно решить,-это взаимоотношение между сайтами разрезания на двух цепях ДНК. Это удалось выясниттч используя условия, при которых фермент образуег двухцеиочечные разрезы, Исследуя концы образовавигихся двухцеиочечных фрагментов, можно понять взаимоотношение между разрезами, сделанными на двух разных цепях. Результаты такого исследования суммированы на рис.
29.14. Фермент ДНКаза 1 разрезает две цепи на расстоянии 2 и.н. Фермент ДНКаза П разрезает их на расстоянии 4 п,н. По отношению к точке симметрии разрез, сделанный ДНКазой 1, отклоняется на одно основание в сторону 3'-конца, а ДНКаза П делает разрез, отступя па два основания в направлении Зчконца. Нуклеаза микро- кокков делает один разрез в обеих цепях, отступя на одно основание в направлении 5'-конца.
Вероятнее всего, что все ферменты узнают одну и ту же точку„но разрезают ДНК на определенном расстоянии от этой точки, определяемом индивидуальной геометрией ферментов. Наиболее существенный вывод, который можно сделать из этих результатов, состоит в следующем: сайт разрезания представляет собой короткий отрезок (порядка 3 — 4 иар оснований), в котором фосфодиэфирные связи в обеих цепях открыты для действия нуклеазы.
Аналогичный вывод был сделан при детальном исследовании в гелях высокого разрешения фрагментов одной цепи с концевой меткой, полученных ири разрезании минимальной нуклеосомы ДНКазой 1 илн П. Пример тахого эксперимента показан на рис. 29.15. В каждом сайго действительно существуют 3 — 4 положения, в которых может произойти разрез, т. е.
сайт разрезания определяется с точностью + 1 п.н. Относительная интенсивность разрезания указывает на зо, что некоторые положения оказываются предпочтительнее других. На основе полученной картины можно подсчитать нсреднююи точку разрезания. При этом видно, что нуклеотидные пары сайтов от К! до 84 лежат на расстоянии 10,0 и.н. друг от друга, сайты от 84 до 510 разделены на 10,7 п, н., а для сайтов 367 29. Нуклеосомные частицы и структура хроматииа НМ 1и НМ 1П нм !и 1 ??? !ч 7~~~~~~~.
Н М вЂ” нукнзззз мнквокок кон ! — ДНКззз1 и и лн и — Каза ° — ю к снм отп Нерешенный вопрос о периодичности ДНК Рис. 29.15. Высокоразрешающий анализ показывает, что каждый сайт длй ДНКазы 1 состоит яз нескольких соседних чувства шльных фосфодцэфирных связей, как зто видно ца представленном примере сайтов 54 и 55 в ДНК частиц минимальной нуклеосомы, ясследованаых с введением концевой метки. (Фотография любезно првлоотавлонз Ьеопзтб Ьцггвг.) 5!3 $12 ЫО Рис. 29.1б. Большинство открытых положений в ДНК повторяется с перяодячцостью, о~ражаюшей структуру двойной спирали !для четкости показаны только сайты в одной цепи).
Сзйты рззрзззиин нз порай цепи Свиты разрезания ДН Козой Одна цепл ДНК гйзугвн цепь ДНК Рнс. 29.14. Каждая нуклеаза разрезает ДНК на определенном расстоянии между сайталгн ца обеих цепях. от 910 до 813 расстояние снова становится равным 10,0 п. н. (Поскольку мы анализируем среднее положение, сайты оказываются разделены не целым числам оснований.) Эксперименты, в которых анализируют ДНК на нуклеосомах по ее чувствительности к нуклеазам, проводят по методу, близкому к методу отпечатков (!оогрнпг), Таким образом, мы можем связывать утрату реакции в определенном сайте-мишени с такой структурой нуклеосомы, в которой данные положения на ДНК стали нечувствительными, Но какова причина периодического разрезания через 10,7 п.н.? Эта периодичность близка к периодичности В-формы ДНК.
Означает ли это, что повторяемость чувствительного сайга просто отражает иммобилизацию ДНК на гистоновом октамере? Это может происходить так, как изображено на рис. 29Д6, где пик чувствительных сайтов встречается в каждой цепи с периодичностью, определяемой числом пар оснований на виток двойной спирали. Некоторый свет на этот вопрос может пролить сравнительный анализ ДНК, иммобилизованной на плоской поверхности !ситуация, рассмотренная на рис. 29.16).
В этом случае сайты нарезаются на расстоянии ровно 10,6 п.н. Это, вероятно, означает, что свободная ДНК (т. е. выделенная в растворе), имеет двуспиральную структуру В-типа, у которой повторяющаяся длина равна 10,6 п.п. С помощью измерения числа пар на ниток, вьпюлненных другим методом, получено очень близкое значение — !0,4 п.н. Мы считаем, что при иммобилизации ДНК на плоской поверхности периодичность разрезания (расстояние межлу точками расщепления) действительно соответствует структурной периодичности (число пар на виток двойной спирали). Вариации в периодичности разрезания ДНК минимальной нуклеосомы (10,0 на концах и ! 0,7 посередине) затрудняют интерпретацию этого явления. Одно из предположений заключается в том, что структурная периодичность ДНК минимальной нуклеосомы действительно варьирует.
В средней части она более близка к В-форме, а на концах может быть закручена слабее. Другая возможность состоит в том, что сама ДНК имеет постоянную периодичность, но геометрия нуклеосомы вызывает смещение мест разрезания в средней части. Если в некоторых положениях доступ ферменту Часть ЧП1. Упаковка ДНК ограничен, он может изменить свой выбор среди 3 — 4 доступных связей.
В эгом случае периодичность разрезания не будет соответствовать структурной периодичности. Если зто так, то что такое структурная периодичность7 При отсутствии необходимых данных нужно построить модель, для того чтобы увидеть, какое из предположений может обеспечить доступ фермента к ДНК. Идеи о меняющейся структурной периодичности или о фиксации расстояния в 10,6 п.н. оказываются менее подходящими, чем предположение о существовании в нуклеосоме постоянной периодичности с 10,0 п.н. на виток. Некоторые интересные выводы вытекают из данных, дающих основание думать, что структурная периодичность ДНК в нуклеосоме (10,0) и ДНК в растворе (10,6) может быть различной.
При освобождении ДНК из нуклеосомы она должна становиться более скрученной, так как у нее больше пар оснований на виток. Это изменение уменьшит степень ее суперспиралнзацин. Предположим, что ДНК проходит в нуклеосоме путь, равный двум оборотам суперспирали. Затем удалим гистоновый октамер. Некоторое напряжение скручивания приведет к большему закручиванию ДНК, и только остаточное напряжение должно измеряться как суперспиральное.
Это один из возможных способов согласовать модели для — 2 супер- спиральных витков на нуклеосоме с данными, в которых определен только — 1 супервиток. Поскольку различие в периодичности (О,б на оборот спирали), умноженное на число супервитков, приходящихся на нуклеосому ( > 15), примерно равно 10 п.н. и соответсзвует одному обороту двойной спирали, то таким образом есть потенциальная возможность поглотить 1 отрицательный супервиток. И еше одно важное замечание нужно сделать относительно укладки ДНК в нуклеосоме и ее возможной степени суперспирализации. Все обсуждавшиеся данные были получены с использованием препаратов минимальной нуклеосомы. В моделях, объясняющих противоречивость данных о числе супервитков, предполагается, что линкерная ДНК уложена таким же способом, что и ДНК минимальной нуклеосомы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
