Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 168
Текст из файла (страница 168)
Упаковка ДНК Глава 30 НУКЛЕОСОМЫ В АКТИВНОМ ХРОМАТИНЕ Появление модели, описывающей хроматин как нить двуспиральной ДНК, закрученной вокруг серии нуклеосом, явилось первой критической вехой в выяснении способа организации генетического материала в ядре. Это несколько статический взгляд на строение отдельной субъединицы и (в некоторой степени) на его взаимоотношение со следующей субъединицей. Нам еще предстоит рассмотреть вопрос о том, происходит ли образование нуклеосом на этой нити случайным образом или это определяется специфической последовательностью ДНК.
Организация хромосом в действительности должна быть достаточно гибкой, для того чтобы удовлетворять различным требованиям, предъявляемым к структуре и функциям хроматина. Например, наличие нуклеосом характерно как для эухроматина, так и для гетерохроматина. Можно ли идентифицировать наборы нуклеосом, различные свойства которых объясняли бы структурные и функциональные свойства определенных участков хромосомы? Являются ли нуклеосомы единственным типом структуры, построенной из нити двухцепочечной ДНК и белка, или же для некоторых участков характерны другие структуры? До сих пор мы рассматривали структурные изменения в хроматине, главным образом исходя из того факта, что в митотических хромосомах эухроматин обязательно должен принимать более плотноупаковаиное состояние.
Это периодическое изменение охватывает весь эухроматин более или менее одновременно. Вероятнее всего, что этот процесс контролируется изменениями в белках, широко распределенных по всему хроматину. Изменения противоположного типа происходят при событиях двух типов, имеющих место только в таких топологических условиях, когда структура находится в растяну~ам состоянии. Это репликация и транскрипция.
В растущей клетке во время интерфазы весь хроматин должен удвоиться. Репликация происходит как серия индивидуальных событий в небольших участках (репликонах). При этом удваиваются соответствующие участки двухпепочечной ДНК, каждый из которых связан с набором гистоновых октамеров. Какие события происходят при удвоении нуклеосомной частицы, пока еще не установлено (гл. 29), однако разделение цепей родительской ДНК, по-видимому, должно неизбежно нарушать структуру, по крайней мере хроматиновых нитей размером 30 нм, а, возможно, также и нитей размером 10 нм.
Было бы интересно установить протяженность такого нарушения. Происходит ли оно только поблизости от точки синтеза ДНК или затрагивает и более удаленные участки? Существуют ли заметные структурные различия между участками, которые уже реплипированы, и теми, которым это еще предстоит? Быстротечность репликационного события значительно осложняет анализ структуры отдельного участка в момент его репликации. При транскрипции также происходит раскручивание ДНК, и, вероятно, поэтому требуется расплетение нити в ограниченном участке хроматина.
Нетрудно догадаться, что для осуществления этого процесса необходимо некоторое пространство. Особенности политенных хромосом и хромосом типа «ламповых щеток», описанные в гл. 28, дают представление о том, что более пространная структурная организация может быль связана с экспрессией гена. Хотелось бы выясниь, какие структурные изменения происходят прн транскрипции гена. Сохраняет ли он нуклеосомную структуру, и если да, то что происходит с нуклеосомой, когда РНК-полимераза транскрибирует ее ДНК? Затрагивают ли общие структурные изменения активной единицы транскрипции только участок, связанный с РНК-полимеразой, или и другие последовательности, расположенные за пределами этого участка? Чем определяется исходная чувствительность промотора к ферменту? Можно ли идентифицировать серии нуклеосом, различные свойства которых объясняли бы структуру или функцию определенных участков? И являются ли нуклеосомы единственным типом ДНК-белковой структуры в двухцепочечной нити или существуют другие структуры, характерные для определенных участков? Как ни важны эти вопросы, на самом деле они служат лишь как бы введением в основной вопрос, связанный с экспрессией генов.
Что изменяет состояние гена, делал его способным к транскриниии в нунсное время и в нунсном месте? Из этого вопроса вытекает второй вопрос: возможно ли выключение гена, и если да, то каким образом? Существует ли упорядоченность в расположении нуклеосом? Мы знаем, что 1п чйго можно реконструировать нуклеосомы безотносительно к последовательности ДНК. Однако это не исключает того, что и Ичо их образование может контролироваться последовательностью нуклеотидов. Находится ли специфическая последовательность ДНК всегда в определенном положении по отношению к топографии нуклеосомы )и чгко? Или же нуклеосомы расположены на ДНК случайным образом так, что специфическая последовательность в одной копии генома располагается в участке минимальной нуклеосомы, а в другой приходится на межнуклеосомный промежуток? Чтобы исследовать этот вопрос, нужно взять ДНК с известной последовательностью или, что более точно, нужно установить положение определенной точки в ДНК относительно нуклеосомы.
На рис. 30.1 изображена принципиальная схема такого эксперимента. Предположим, что определенная последовательность ДНК организована в нуклеосомы только одной конфигурации так, что каждый участок в ДНК локализован в нуклеосоме всегда в одном и том же положении. Это называют фазирвванием нуклеосом. В серии фазированных нуклеосом линкерные области ДНК заключают в себе уникальные сайты. 30. Нуклеосомы в активном хроматине Рзоцеппзиие иукпеззай микракаккап р~р~у~у~~~~~~~~ Нмдепеии ДНК ирзсще пе ие реатр к ирующи фермпттам ДНК падеергзют зпектрафарезу, перецаспт гибридизуют с заидащ предс ееппющим сабай мюпедазз епьиаатщ 1ЮОПОЛО ЦЗ УЮ РЯАОМ с сзйтам рестрикции ХЮЛМ Едииат еи з па ссз саатяетатеует фрзгмипу, атреззииаму с адиай стОРа«м Рзстрик ярую щ фермеи ам,зс аругай иукпеззай ми Ракаккап 1 з — -е ф Рнс.
30.!. Благодаря нуклсосомиому фазироввнию сайгы ре- стрикции попадают в уникальные положения лннксрных учбст- ков, которые разрезаются нуклеазой микрококков. Рассмотрим последовательность только для одной нуклеосомы. При расщеплении нуклеазой микрококков образуется мономерный фрагмент, состоящий из сиецифиЧЕСКОй цОСгесдабаиГСЛЬНОСнги. ЕСЛИ ВЫдЕЛИтЬ ДНК И раещепить ее рестриктируюшим ферментом, лля которого имеется только один сайт рестрикции на этом фрагменте, то ДНК будет разрезана только в одной точке. При этом образуются два фрагмента, каждый с уникальным размером. Продукты двойного расщепления нуклеазой микрококков и рестриктирующим ферментом разделяют с помощью электрофореза в геле.
Для идентификации фрагментов, образованных в результате двойного расщепления, используют специальный зонд, представляющий собой последовательность ДНК, непосредственно примыкающую к сайту рестрикции !с одной стороны). Этот метод называют непрямым концевым мечением уне совсем соответствующее название). Иначе говоря, идентификация одной четкой полосы показывает, что положение сайта рестрикции однозначно определено по отношению к концу нуклеосомной ДНК !который соответствует разрезу нуклеазой микрококкон). Таким образом, нуклеосома обладает уникальной послеловательностью ДНК. Что происходит в том случае, если нуклеосома не занимает одно-единственное положение? Эта возможность рассматривается на рис.
30.2, где показано пять возможных способов локализации нуклеосомы на одной последовательности ДНК. Но в действительности их может быть столько, сколько пар оснований находится в повторяющейся единице. В этом случае в каждой копии генома линкерная ДНК состоит из разных последовательностей ДНК. Сайты рестрикции каждый раз лежат в разном положении. В действительности они могут находиться но всех возможных положениях по о~ношению к концам мономерной нуклеосомной ДНК.
Отдельный мономерный фрагмент, полученный после расщепления нуклеазой микрококков, может быть представлен разнообразием последовательностей; под действием рестриктируюшего фермента этот фрагмент распадается, образуя непрерывную серию более мелких фрагментов.
Если мы примем, что наименьший фрагмент, который можно идентифицировать методом гибридизации, содержит 20 пар нуклеотидов, то в описанном выше опыте мы получим размазанное пятпю, содержащее фрагменты от 20 п.н. до полной длины мономерной ДНК. При анализе реальных последовательностей интерпретация результатов оказывается несколько сложнее.
В сдучае больших геномов невозможно достаточно точно идентифицировать один уникальный фрагмент. А нам нужно узнать, фазирована ли нуклеосома не только в одной короткой последовательности, а на протяжении некоторого важного участка. Так, при попытках исследовать фазирование нуклеосом часто используют тандемно повз.оряюшиеся последовательности. При этом подходе нужный фрагмент эффективно амплифицируется. В таком случае изучение отдельного фрагмента позволяет устапо- ~~г"~~~~уз~~ + 1 1 ! Пере Ос и ф гибриди зция ! сза дам для 1 юР»ОА паспеда- зт гюас ! ~Я~УМ -------+ — — — — — 1 Рис. 30.2.
Прн отсутствии нуклсосомною фазнрования снйт ре- стрикции попадает во все возможные точки локализации в раз- ных копиях генома. Не рисунке показаны результаты образования разрывов справа Ог чер- пай последовательности н в местах соединения нуклеосом. З78 Часть УП1. Упаковка ДНК вить, фазирована ли данная последовательность в каждой из повторяющихся единиц генома.
Такие зонды были использованы для изучения фазироваиия сателлитных ДНК, тРНК, 5Я-ДНК, а также гистоновых генов. В этих случаях фазирование нуклеосом может иметь место только при условии простых взаимоотношений между длиной нуклеосомного повтора и длиной тандемно повторяющейся единицы. В болыпинстве случаев экспериментальные данные не получаются такими четкими„как в опыте, показанном на рис. 30.1 для однозначного расположения нуклеосом. Но иногда они достаточно сильно отличаются от широких полос или размазанных пятен, предполагаемых для случайной локализации. Из этих экспериментов действительно следует, что число сайтов разрезания нуклеазой микрококков ограничено немногими положениями по отношению к конкретным сайтам рестрикции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
