Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 163
Текст из файла (страница 163)
Нуклеаза ыякрокекков ступенчато уменьшает длину ДНК нуклеосомных мономеров. (Фогагрпфпя пюбезпп прпдоегпвпгпа Яокгг Кпгпьпгк.! ким-то другим фактором, а не четырьмя гнстонами сердцевины (гистонового кора). Эксперименты по реко~струкции 1п «!1го показывают, что гистонам присуща способность организовывать ДНК минимальной нуклеосомы, но не полную цуклеосому, длина ДНК в которой характерна лля состояния 10 ч!чо. В этот процесс должны быть включены гистон Н1 и (или) негистоновые белки, которые связаны с гистоновым ок.гамером в природных сериях нуклеосом.
Первичная реакция может зависеть от «белков сборки», которые участвуют гп»гко в образовании нуклеосом нз гнстонов н ДНК, но которые не становятся частькэ нуклеосомной структуры (см, ниже). Мы уже говорили„что гистон Н! теряется при деградации мономерных нуклеосом. Он еще остается в моно- мерах, содержащих 160 — 170 п. н. ДНК, но всегда теряегся при последующем уменыпении до минимальной хромосомы размером 146 и.
н. На основании этого факта можно предположить. что гистон Н( располагается в области линкерной ДНК, непосредственно прилегающей к ДНК минимальной нуклеосомы. ДНК закручена вокруг гистонового октамера Два типа данных независимо говорят о том, что ДНК, очевидно, лежит на поверхности нуклеосомы, обвиваясь снаружи вокруг гистонового октамера. Согласно бнофизическим данным, диаметр белкового компонента нуклеосомы меньше, чем диаметр витка ДНК.
Биохимические данные показывают, что ДНК чувствительна к нуклеазам в участках, расположенных через определенные интервалы (см. ниже). Часть ЧШ. Упаковка ДНК Рис 29.7. Нуклеосому можно представить в виде цилиндра с двумя витками ДНК, закрученными снаружи вокруг него. Нуклеосомы имеют в основном форму эллипса. Отношение осей равно 0,5 и соответствует размерам 11 х 11 х х 6 им. По своей форме нуклеосомы обычно представляет собой плоский цилиндр диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Даже на основе измерений кажется яероятным, что ДНК лежит снаружи. Окружность частицы, составляющая примерно 34 нм, сравнима с длиной ДНК - 67 нм (200 п. ы.). Трудно представить, каким образом ДНК могла бы втиснуться в такую частицу, Свойства отдельных компонентов можно измерить с помогдью рассеяния нейтронов.
Этот метод позволяет различить рассеяние, обусловленное ДНК, от рассеяния, обусловленного белком. Измерения показали, что белковый компонент (гистоновый октамер) имеет радиус вращения около 3,2 нм, но радиус вращения ДНК-компонента составляет примерно 5,2 нм. Разница в 2 нм соответствует диаметру двойной спирали ДНК. На основе этих данных было высказано предположение, что белок организован в компактное тело, вокруг которщ о намотана ДНК. Существуют различные модели, описывающие способ укладки ДНК в нуклеосоме.
Наиболее общими чертами всех моделей является то, чю структура должна быть симметричной и что ДНК проходит вокруг октамера дважды. На рие. 29.7 схематически изображена ДНК, лежащая в виде двух витков спирали. Из этой схемы следует, что ДНК «входит» и «выходит» из нуклеосомы в точках, близко расположенных друг к другу. Однако до сих пор не уделяется достаточно внимания вопросу о том, с помощью какой модификации в укладке можно объяснить вариации длины ДНК в нуклеосоме. Рассматривая модель, изображенную на рис.
29.8 в виде поперечного сечения, можно видеть, что два витка ДНК лежат близко один к другому. Это, возможно, имеет функциональное объяснение. Один виток вокруг нуклеосомы захватывает 80 п.н., так что точки, отстоящие на это расстояние в свободной двойной спирали,могут оказаться расположенными достаточно близко друг 0«» «им»«юи» Радиус вращени«белка Р««»ус врд~ц«ни« дик Рис. 29 8. Два вятка ДНК в вуклеосоме должны лежать совсем близко друг к другу. к другу на нуклеосоме.
Таким образом, если ДНК-связывающий белок одновременно контактирует с двумя витками ДНК, как показано на рис. 29.9, узнаваемые им последовательности могут отстоять на двойной спирали ДНК 1ораздо дальше, чем величина соединяющего их участка в белке.
Часто обсуждается вопрос о том, может ли стартовая точка транскрипции находиться поблизости от положения — 80 так чтобы обе цепи одновременно контактировали с РНК-полимеразой. (Это внесло бы конкретную деталь в обобщенную модель, показанную на рис. 11.8). Плотность упаковки отдельной нуклеосомы равна примерно 6 (так как 67 нм ДНК упакованы в частицу длиной около 11 нм). Можно упаковать серию нуклеосом достаточно плотно, чтобы сохранить это отношение.
Множество работ по изучению наборов нуклеосом было выполнено на вирусе ЯЧ40. ДНК вируса 8940 представляет собой кольцевую молекулу в 5200 п.ы., контурная длина которой равна примерно 1500 нм. И в состоянии вириона, и будучи иньецированной в ядро, она упакована в серию нуклеосом. В этой форме ее называют мини-хромосомой. Прв обычном выделении контурная длина мини-хромосомы равна примерно 210 пм, а плотность ее упаковки составляет примерно 7. Изменение в концентрации соли может превратить ее в гибкую нитку бус со значительно более низкой плотностью упаковки.
Из этого следует, что нуклеосомиые ыити 1п чйго в зависимости от условий могут находиться в более чем одыой форме. Важным параметром в описании структуры хроматина является степень суперспирализации, которая может возникнуть на нескольких уровнях. Во-первых, суперспирализация может быть результатом упаковки ДНК на нуклеосоме.
Во-вторых, суыерспирализапия може~ быть следствием укладки нуклеосом в структуру более высокого уровня. Состояние суперсцирализации во многом может удерживаться белками (по принципу, описанному в гл. 28). Прямые измерения плотности сунерспирализации позволят узнать среднее напряжение скручивания ДНК, возыикаюшее в результате образования свободыых суыервитков, но таким образом нельзя обнаружить суперспирализации, которая удерживается в ходе упаковки ДНК. Для мини-хромосомы вируса ВЧ40 можно прямо измерить степень суперспирализации в самой нуклеосоме.
Мини-хромосома может иметь свободные супервитки в гирлянде нуклеосом, а также супервитки, удерживаемые на нуклеосоме. Процедура измерения суперспирализации, обусловленная только структурой нуклеосом, показана на рис. 29.10. Сначала освобождаются свободные супервитки самой мини-хромосомы, так что гирлянда нуклеосом образует кольцо с нулевой суперспирализацией. Затем экстрагируют гистоновые октамеры.
В результате этой процедуры освободившаяся ДНК свободно расправляется. Таким образом каждый супервиток, который сдерживается в мини-хромосоме, проявится в депротеицизированной ДНК как — 1 оборот. Так можно измерить общее число супервитков в ДНК вируса ЪЧ40, Действительно, наблюдаемое значение близко к числу нуклеосом. Противоположный результат наблюдают при сборке нуклеосом !и гйго на суперспирализованной ДНК 8Ч40: образование каждой нуклеосомы удаляет -1 отрицательный супервиток. Таким образом, если удалить удерживающий белок, то ДНК, уложенная ыа поверхности нуклеосомы, образует 1 отрицательный суперви- 29, Нуклеосомные частицы и структура хроматина 365 ~~~ХОс ап ан дни С) сензыеажщ й бе ок ДНК санзыве щие сайуы близко расположены на нукпеосоме м~ъюябм%~%6%9м%хьмбьяьъюучь~жкхям ток.
Следует отметить, что существует потенциальное расхождение между измеренным значением, равным — ! оборот на нуклеосому, и моделью, согласно которой укладка ДНК в нуклеосоме эквивалентна — 2 сверхспиральиым оборотам (см. ниже). ДНК, симметрично обработанная нуклеазами Ферменты ДНКаза 1 и ДНКаза П вносят одноцепочечиые разрывы в ДНК. Это означает, что они разрывают связь в одной цепи, тогда как вторая цепь остается в этом месте интактной. В результате цепь в целом кажется непрерывной, однако при денатурации вместо цепей обычной длины высвобождаются более короткие фрагменты (рис. 29.11).
Если ДНК находится в растворе, одноцепочечные разрывы (ники) возникают случайно. В ДНК, находящейся иа нуклеосомах, такие разрывы могут быть образованы с помощью ферментов, но только в определенных точках. Разрывы образуются через определенные промежутки так, что при электрофорезе денатурированной ДНК получается лестница. В экспериментах этого типа фрагменты денатурированной ДНК мокнут соответствовать расстоянию от конца нуклеосомы до места разрыва нли могут быть образованы в результате двух внутренних разрывов. Настоящие точки разрыва можно установить, используя концевую радиоактивную метку с последующей радиоавтографической идентификацией фрагментов.
Как показано на рис. 29.12, будут обнаружены только фрагменты с концевой меткой. (Этот метод аналогичен методу секвенирования, показанному па рис. 3.4, или методу отпечатков-.рис. 11,4.) Суперсп рал завалив жромссом Удаве ие супервюков Репа сираеаннм н -зромосо а Удало ие с озонов Суперсп рз омщ м дйк Рлс. 29.9. Через белок может осуществляться контакт последовательностей ДНК, находящихся в различных витках иа пуклеосоме. Рис.
29.10. Супервитки мини-хромосомы месут релаксировать и превратиться в кольпевую структуру, которая после удаления гисюнов образует суперспирализоваиную свободиую ДНК. сай ь с зь ва н мосуу быуь далеко уд е ы а аьп у ой днк Лестница, полученная в результате обработки ДНКазой 1, показана иа рис. 29.13. Похожие результаты получают цри аналогичной обработке хроматииа. (Действительно, для таких экспериментов ш И1го обычно используют препарат минимальных нуклеосом, так как трудно получить препараты полных нуклеосом с гомогенным распределением по размеру фрагментов ДНК.) Интервал между последовательными ступенями лестницы составляет примерно !О оснований. Лесгница вытягивается на всю длину ДНК минимальной нуклеосомы; сайты расщепления пронумерованы от Б! до $!3 (где Я расположен через !О оснований от меченого 5'-конца ДНК, 82 — через - 20 оснований и т.д.).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
