Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 158
Текст из файла (страница 158)
гл. 31). Однако из-за неравномерного распределения они нестабильны в митозе и мейозе и исчезают из большинства клеток. Выделены фрагменты хромосомной 28. О геномах 353 и хромосомах П 1 1П 1У , 2 атМСтеаеатеат Ктятттоаы тткттатяттптаааММатКМКаятакаааотаотттатттттКММятааКятттММтаттастотат СятттСССАА тттасассм ТАТТСАСТЬТАСТ ТАТАААСТААААТААТАТАААААТТТТТТТСАТТТТТТАТТТТТСАТСАААТАААААТТТТТТАТТТТАААТТТТАТААТСАСАТА СТАААСССТТ (ммтстсстт) 87п.нтчэи А«Т1 248 п.н. и атмстсасатсат аааасататттмаяттттммматтяяттттсамятямтыяттататттттттмктасатаатсатмакатякатсыс тсатттсссаа Гтттясяссяя) Ск~" таттсястстяст ттттстятамттттмамттттттмттммсттттятттмятмтатммямтттатстяттастятттттатттясмс стмяссстт ямтстсстт П П.Н. 251 П.Н вв п.ндваиа+ т1 14 п.н Рнс. 28.11.
Прн сравнении нуклсотидной последовательности локусоа СЕАТЗ н СЕТТ111 дрожжей найдены четыре консервативных участка, 21-11О2 ДНК, которые придавали этим плазмидам митотическую стабильность. В одном из случаев в таком фрагменте оказался генетический маркер, расположенный рядом с центромерой, что подтверждало происхождение фрагмента. Несколько СЕ)т)-фрагментов были охарактеризованы.
У них отсутствуют протяженные области гомологии, по тем пе менее им присущи общие свойства. Элемент 1 состоит из последовательности в 14 и. ип которая с некоторыми вариациями встречается во всех центромерах. Элемент 11 представляет собой АТ-богатую (> 90;й) последовательность из 82-89 п.нп которая обнаружена во всех центромерах. Вполне возможно, что ее функция зависит от размера, а не от точной последовательности. По своему составу этот фрагмент напоминает некоторые сателлитные ДНК высших эукариот. Элемент П1 состоит из !! и,н, и почти полностью гомологичен во всех известных центромерах. Ни в одной из центро- мерных последовательностей нет открытых рамок считывания.
Для того, чтобы прямо определить, какие признаки необходимы для выполнения функции центромер, можно индуцировать делении и другие изменения в этой области. Однако трудно исследовать функции центромер непосредстненно в плазмидах. Хотя плазмиды с СЕАт-последовательностями стабильнее, чем плазмиды без них, они все-таки гораздо менее стабильны по сравнению с аутентичными центромерами. Отсутствие стабильности, по-видимому, связано с малым размером плазмиды, а не с каким-то повреждением в СЕАт-области.
Другим способом использования доступных центро- мерных последовательностей может быть их модифика- ЦИЯ ТП ГИ1ГО С ПОСЛЕДУЮЩИМ ВВЕДЕНИЕМ В ДРОжжЕвые клЕтки, в которых они могут заменить соответствующие центромеры хромосом. Если хромосомная центромера заменена СЕ)т(-фрагментом, из которого удалены консервативные последовательности, то соответствующая хромосома ведет себя в митозе, как ацентрический фрагмент: она не может нормально сегрегировать. Это прямо показывает, что СЕХ-фрагмент действительно несет информацию, необходимую для функционирования центро- меры. Если СЕА1-фрагмент из одной хромосомы переносят вместо центромеры в другую хромосому, то не обнаруживают никаких изменений. Этот результат говорит о взаимозаменяемости центромер.
Они просто используются для прикрепления хромосомы к веретену и пе итрают никакой роли в том, чтобы отличить одну хромосому от другой. Первыми были обнаружены два таких фрагмента, СЕ1Т'3 длиной 627 п. н. и СЕ)т(!1 длиной 900 и, н. (Цифро- ное обозначение покуса соответствует порядковому номеру хромосомы.) Интересно, что эти маленькие участки обеспечивают адекватное поведение в митозе, но не выполняют сегрегационной функции в мейозе. Возможно, для спаривания и сегрегации хромосом в первом мейотическом делении нужны более протяженные участки ДНК, чем для простого митотического деления.
Нуклеотидная последовательность обоих участков СЕА13 и СЕА'11 определена. Эти участки не содержат протяженных областей гомологии. Существует несколько коротких гомологичных участков, а также (А — Т)-богатые области равной длины. На рис. 28.11 показаны консервативные последовательности этих двух участков. Важное значение имеет, очевидно, то обстоятельство, что в обеих центромерах короткие гомологичные участки расположены на одинаковом расстоянии друг от друга. Ни в одной из центромер не обнаружено открытых рамок считывания. Существует некоторое сходство между этой последовательностью и определенными последовательностями сателлитной ДНК у высших эукариот.
Эти участки можно будет использовать для получения делеций и других изменений, необходимых для того, чтобы непосредственно установить, какие именно свойства центромеры обеспечивают выполнение ее функций. Другим важным признаком всех хромосом является теломера. Мы до сих пор еще не понимаем до конца природу этих «печатей» на копнах хромосом. Уже давно ясно, что концы должны иметь особую структуру, поскольку при разрыве хромосом образуются «липкие» концы, склонные к взаимодействию с другими хромосомами, тогда как естественные концы хромосом стабильны. При идентификации теломерной последовательности следует использовать два критерия.
Во-первых, такая последовательность должна лежать на конце хромосомы (или, по крайней мере, на конце аутентичной линейной молекулы ДНК). Во-вторых, она должна придавать линейной молекуле стабильность. Используя критерий локализации, теломеры можно выделить из необычных компонентов геномов низших эукариот. Одним из источников являются линейные молекулы рДНК, другим -ДНК макронуклеуса некоторых инфузорий. Несмотря на значительную эволюционную отдаленность этих форм генетического материала, все теломеры имегот некоторые общие особенности.
Теломеры состоят из длинных серий коротких, тандемно повторяющихся последовательностей. В табл. 28.3 приведен перечень повторяющихся единиц, идентифицированных на концах линейных молекул ДНК. Их всех можно записать в общем виде как Сп(А)Т)ж, где и > 1, а Ач равно 1 — 4. 354 Часть ЧП1. Упаковка ДНК Таблица ЖЗ Теломеры еодердзат короткое тлндемные повторы оба!его тнпя' Нствялвк ДНК Повторяюювяся сдвввцв (5 — 3) Оргвпвзм Инфузории отряда Но!огг!с(зв (наирнмер, Тетасяутепа, Рагатесып) Инфузория отряда Нурозг!с(за (напрнмер, Яву!опс/ца, Охуг !сна) Жгутнковые (напрнмер, Бурапазапю, Уе(сатин!а) Слнзевнкн Р)зу запал Пзсзуажецит Дрожжи (Басс(загогиусез) Макронуклеус ССССАА Макронуклеус ССССАААА СССТА Мини-хромо- сома СССТА„ с, т Сз — зА(СА)з - з РДНК рДНК Хромосома ' Повторяювзвзся единицы дввы в виде последовательности одной цепи в явпрввлвцня от звломеры в центру В пределах теломерной области существует специфический ряд одноцеиочечных разрывов, структура которых препятствует их сшиванию лигазой, зашиваюШей обычно разрывы в одноцеиочечной ДНК.
Основания, расположенные на самом конце, оказываются каким-то образом блокированными — они могут образовывать шпильку-так что нуклеазы их не узнают. Для изучения данной функции на молекулярном уровне и на этот раз были использованы дрожжи. Все плазмиды, выживающие в дрожжевых клетках, являются кольцевыми молекулами ДНК. Линейные плазмиды нестабильны (поскольку они деградируют).
Могут ли аутентичные теломерные последовательности ДНК придавать стабидьность линейной плазмиде? Оказалось, что концевой участок из естественной линейной последовательности ДНК-экстрахромосомной рДНК Тетра)зутепи †способ придать стабильность линейной дрожжевой илазмиде. Эта предполагаемая тело- мера состоит из повторяюШейся последовательности, содержащей серию одноцепочечных разрывов. Эти разрывы располагаются у дрожжей в одних и тех же сайтах и проявляют явную межвидовую консервативность.
Каждый конец линейной ДНК может иметь форму зппильки. Последовательность ДНК Те!ги)зутепа можно заменить некоторыми фрагментами дрожжевой ДНК, содержашими родственные последовательности. Пока что они выделены в виде фрагментов размером около 4 т.п.н. Предстоит доказать, что они являются естественными теломерами дрожжевых хромосом. Для того чтобы выяснить, как они функционируют, следует провести исследования такого же типа, как и при изучении центромерной ДНК-а именно использовать метод уменьшения размера и индуцировать мутации. Некоторое предо~веление о том, как функционирует теломера, дают необычные свойства концов линейных молекул ДНК.
В популяции трипаносом длина концов молекул рДНК различна. Если проследить за судьбой одного клона, то оказывается, что длина теломеры увеличивается на 7-10 п. н. в расчете на одну генерацию. Еше более показательна судьба теломер инфузорий, введенных в дрожжевые клетки. После репликации в этих клетках к концам повторов Теггайутепа присоединяются теломерные последовательности дрожжевых клеток.
Похоже на то, что добавление теломерных повторов к концу хромосомы происходит в каждом цикле репликации (таким образом, вероятно, разрешается проблема репликации линейных молекул ДНК, обсуждаюшаяся в гл. 33). Некий механизм должен препятствовать чрезмерному росту концов, очевидно, удаляя часть повторов. Если теломеры постоянно удлиняются, их последовательности могут не соответствовать точно друг другу. Все, что от них требуется, зто только чтобы данный конец был узнан как походяший субстрат для добавления. Это объясняет, каким образом теломера инфузорий функционирует в дрожжах. Однако мы еше не понимаем, как теломерная последовательность связана с устойчивостью хромосомных концов к повреждениям.
Минимум требовали!ь необходимых для сушествования индивидуальной хромосомы, сводится к наличию 1) соответствующей целостности теломеры, 2) центромеры для поддержания сегрегации и 3) точки инициирования репликации (гл. 31). Все эти элементы были объединены для создания синтетической дрожжевой хромосомы. Оказалось, что синтетическая хромосома стабильна только в том случае, если ее длина превышает 20 — 50 т. и.н.
Мы пока еШе не знаем природы этого явления, но само создание синтетической хромосомы дает потенциальную возможность изучать природу сегрегации генетического материала в контролируемых условиях. Деспирализованное состояние хромосом «ламповых щеток» Для того чтобы установить, какие структурные изменения связаны с транскрипцией, было бы очень полезно пронаблюдать экспрессию генов в их естественном состоянии. Однако организация генетического материала такова, что подобный анализ возможен только в некоторых исключительных случаях. Из-за плотной упаковки ДНК в хромосоме и трудности идентификации местоположения отдельных генов визуализация транскриппии отдельных генов невозможна. (Однако, как это описано в гл.
30, активные гены проявляют некоз.орые характерные особенности, которые можно исследовать !и т!гго.) Митотические хромосомы транскрипционно инертны. Во всяколз случае они так компактны, что в них нельзя различить отдельных покусов. В отдельных участках, которые становятся видимыми ири окрашивании методом О-сегментов (как это показано на рис. 28.9), содержится примерно 10' п.н. ДНК, и в них может поместиться много сотен генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
