Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 162
Текст из файла (страница 162)
Анализ выделенных частиц представлен в верхней части рисунка. Препарат нуклеосом был расфракционирован на моно- меры, димеры, тримеры и т.д. методом седиментации в градиенте концентрации сахарозы. Затем очищали ДНК из каждой фракции н анализировали с помощью электрофореза в акриламидном геле. Электрофорез образцов ДНК показан в нижней части рисунка. Каждая фракция образует полосу ДНК определенного размера. Отдельные полосы соответствуют определенным ступеням лестницы, полученной в результате расщепления хроматина. (Справа на фотографии представлена для сравнения «лестница».) Нуклеосомы- Рнс.
29.4. Нуклсаза микрококкоя расщепляет ядерный хроматин на мультнмерные серии отрезков ДНК, которые можно разделить с помощью тлектрофореза. (гаатагряфял яюбоз о прод«с~а»лола Магам ЫаП.) Часть УШ. Упаковка ДНК Зб2 Седиментация нуклеосом < Тримеры Мономеры Тетрамеры пимены В,О * ао н В й о и 1,0 0 Выделение ДНК для алектрофореза е геле Контроль асщепления яроматина 1000 ВОО 600 Длина днк 400 1п.н.1 200 Рис. 29.5. Каждый мультнмер нуклеосом содержит соотнет- отаующее число единиц длины ДНК.
(Фотография любезно предосзаелена Зоьп 1'юох1 мономеры содержат одну единицу длины ДНК, димеры нуклеосом содержат две единицы длины ДНК и т.д. Каждая ступенька лестницы представляет собой ДНК, соответствуюшую определенному числу нуклеосом.
Таким образом, можно припять, что существование «лестницы», кратной 200 и. н., указъгвает на нуклеосомную организацию ДНК. При обработке нуклеазой микрококков образуется «лестница» только примерно из 2т„' ядерной ДНК, которая переходит в кислоторастворимую фракцию (деградирует до мелких фрагментов). Таким образом, реагирует только часть ДНК, по-видимому соответствующая особенно чувствительным областям. При высвобождении хроматина из ядра или при конструировании нуклеосом гп упго (см. ниже) мы часто видим серии нуклеосом, соединенных нитью свободной ДНК (бусинки на нитке).
Разделены ли обычно нуклеосомы свободной ДНК, или это артефакт, возникающий ш у(зго'? Поскольку зп угео ДНК должна быть плотно упакована, можно а рпоп предположить, что существует (если вообще есть) только небольшое количество свободной ДНК. Это предположение подтверждается данными о том, что более 90",~„' ДНК хроматина оказывается в форме «лестницы» из фрагментов, кратных 200 п, н. Из этого следует, что большая часть ДНК находится в нуклеосомах, а не между ними. В естественном состоянии нуклеосомы, вероятно, так плотно упакованы, что ДНК непосредственно переходит из одной нуклеосомы н другую.
Свободная же ДНК, по-видимому, образуется в результате утраты некоторых гистоновых октамеров в процессе выделения. Длина ДНК, находяшейся в одной нуклеосоме, может несколько отличаться от величины 200 и. нч которая была установлена в первых экспериментах. После того как были исследованы полные геномы из отдельных клеток, оказалось, что в каждом случае полученное значение достаточно точно соответствовало средней величине ( ч- 5 и. н.).
Средняя величина в большинстве случаев находилась между 180 и 200 п, н., но были обнаружены и крайние значения, такие, как 2б0 п. и. (в сперматозоидах морского ежа). Среднее значение может меняться в течение эмбрионального развития. В случае лзорского ежа оно уменьшается до более типичного уровня во время ранних делений эмбриональных клеток. Среднее значение может быть различным в разных тканях взрослого организма. Кроме того, различия могут наблюдаться в разных частях генома в клетках одного типа. Например, извеспгы случаи отличия от среднегеномной величины для сателлитной ДНК и генов 5Я РНК.
Частицы минимальной нуклеосомы высококонсервативны Белковый компонент нуклеосомы представлен гистоновым октамером, вероятно, у всех эукариот. Такое постоянство структуры и функции объясняет строгую консервативность аминокислотных последовательностей гистонов. Чрезвычайная консервативность гистонов НЗ и Н4 обьясняется тем, что их роль может быть центральной и неменяюшейся, тогда как гистоны Н2А и Н2В обеспечивают видоспецифические вариации. Все нуклеосомы состоят из гистонового октамера, связанного с ДНК определенной длины.
Какие же факторы отвечшот за вариацию длины ДНК в нуклеосомах, полученных из различных источников? На этот вопрос легче ответить, определив то, что не вызывает вариаций. Вариации не зависят от изменения в связывании ДНК с гистоновым октамером. Всегда образуются частицы минимальной нуклеосомы (нуклеосомного кора, кор-частицы, соте ратас(е), содержащие 146 и. и. ДНК, независимо от общей длины ДНК в нуклеосоме. Таким образом, варьирует размер ДНК, которая присутствует в нуклеосоме сверх основной структуры кора, Минимальная нуклеосома была идентифицирована по действиго нуклеазы микрококков на нуклеосомный мономер. Реакция этого фермента начинается с ввеления разреза между нуклеосомами. Но если продолжить реакцию после того, как образованы мономеры, то расшенление 29.
Нуклеосомные частицы и структура хроматина 363 захватывает часть ДНК самой нуклеосомы. Эта реакция протекает путем «подрезания» ДНК с концов нуклеосомы. Как показано на рис. 29.6, длина ДНК уменьшается ступенчато. Например, в ядрах печени крысы нуклеосомные мономеры сначала содержали отрезок ДНК в 205 п.н. Потом были обнаружены мономеры, у которых длина ДНК была уменыпена до 160-170 п.н. Затем длина этих мономеров сократилась до размера ДНК в минимальной нуклеосоме- 146 и. н. (эта величина достаточно стабильна, однако, если продолжать гидролиз, разрезы образуются и в пределах такой ДНК. При этом образуется набор фрагментов, из которых самые длинные соответствуют фрагменту ДНК минимальной нуклеосомы, а самые короткие имеют размер 20 п.н.).
На основе такого анализа можно разделить нуклеосомную ДНК на две части. ДНК минимальной нуклеосомы имеет постоянную длину 146 и. н. и относительно устойчива к расщеплению нуклеазами. (Другие нуклеазы, в том числе и нуклеаза микрококков, останавливаются перед этим отрезком ДНК.) Линкерная ДНК заключает в себе остаток повторяющейся единицы. Ее длина может варьировагь гп ягго от такого малого размера, как 8 и. н., до такого болыпого, как 114 и. пп на 1 нуклеосому. Четко ограниченный размер полосы ДНК, образованной в результате первого расгцепления нуклеазой микрококков, говорит о том, что область, непосредственно доступная для действия фермента, ограничена.
К пей относится только часть каждого линкера. (Если бы вся линкерная ДНК была чувствительна, размер полосы колебался бы в интервале от !46 п.н. до отрезка, превышающего размер повторяющейся единицы). Но, после того как лнпкерная ДНК разрезана, оставшаяся часть становится чувствительной и довольно быстро расщепляется ферментом. Хотя частицы минимальной нуклеосомы меньше, чем сами нуклеосомы, их свойства похожи. Они напоминают нуклеосомы по форме н размеру, нз чего можно заключить, что основная геометрия такой частицы устанавливается в результате взаимодействия между ДНК и гистоновым октамером.
Из-за того что минимальные частицы легче получить в виде гомогенного препарата„их исподьзовали для многих структурных исследований вместо препаратов нуклеосом. Мономеры нуклеосом болыпе варьируют в размерах из-за того, что трудно получить препараты, в которых не происходило бы «подрезания» концов ДНК.
Какова физическая природа минимальной нуклеосомы (пуклеосомного кара) и линкера? Эти термины являются операчионааьными определениями для обозначения областей, относительно более и менее чувствительных к обработке нуклеазой. Из этого нельзя делать каких-либо выводов об их действительной структуре. Это не означает, в частности, что линкерная ДНК имеет более вытянутую форму. С другой стороны, путь ДНК в нуклеосоме может быть непрерывным без каких-либо четких различий между этими областями мономера. В действительности это условное рабочее предположение, которое часто делают, пытаясь перейти от структуры минимальной нуклеосомы к структуре нуклеосом. С другой стороны„возможно, что путь линкерной ДНК отличается от пути ДНК в минимальной нуклеосоме, о чем свидетельствуют заметные вариации в длине лип«еров. Существование линкерной ДНК обеспечивается ка- Пары снований 160 140 15с 300 1 3 5 10 Мни Время воздействия ферментом Ряс 29.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
