Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 170
Текст из файла (страница 170)
Эукариотические ферменты — это большие белки, обычно более 500000 дальтон. Сравним это с молекулярной массой нуклеосомы, составляющей 264 000. На рис. 30.3 показан момент приближения РНК-полимеразы к нуклеосомной ДНК. Даже не зная в деталях механизма В ад а аа у Нукпеае а вд сбОку ПНК паппмеаааа Рнс. 30.3. РНК-полиыераза сравнима по размеру с нуклессомой и может испытывать затруднения, продвигаясь по ДНК вокруг нуклеосомы.
их взаимодействия, нетрудно представить, что при этом происходит сближение двух сравнимых по размерам тел. Кажется несомненным, что в процессе их взаимодействия должны происходить структурные изменения. Нукдеосомная ДНК относительно нечувствительна к нуклеазе микрококков. Даже в изолированных частицах минимальной нуклеосомы только часть связей в ДНК оказывается чувствительной к ДНКазе 1, делающей одноцепочечные разрывы (гл. 29). Напомним, что каждая нуклеосома существует не изолированно, а по соседству с другими, и рассмотрим два оборота ДНК, закрученные вокруг нуклеосомы. Все это выдвигает на первый план вопрос о том, имеет ли РНК-полимераза достаточный доступ к ДНК, если нуклеиновая кислота как обычно закручена вокруг нуклеосомы.
Трудно себе прелставитаь что в процессе транскрипции полимераза может следовать по ДНК вокруг нуклеосомы. Таким образом, первый вопрос, касающийся структуры активных генов, заключается в том, организована ли транскрибируемая ДНК в виде нуклеосом. Гены, кодирующие рРНК, можно исследовать под электронным микроскопом. Структура ДНК при этом плохо видна из-за плотного расположения молекул РНК- полимеразы. Это отчетливо вилно на рис. 23.4 и на другом примере, показанном на рис.
30.4. Плотность упаковки ДНК можно подсчитать, разделив известную длину единицы транскрипции, которую измеряют по оси транскрипционной матрицы. Она равна примерно 1,2. Таким образом, ДНК почти полностью вытянута и не может быть организована в нуклеосомы. Нетранскрибируемые спейсеры между транскрипционными матрицами также почти полностью вытянуты; их плотность упаковки составляет около 1,4. При соблюдении в процессе приготовления препаратов определенных условий в спейсерах обнаруживают ббусинытз которые, возможно, являются нуклеосомами. Если это так, то должна быть и свободная спейсерная ДНК, которая их соединяет.
При других условиях получения препаратов спейсеры состоят из свободной ДНК. Все это свидетельствует о том, что состояние ДНК в интенсивно транскрибируемых таидемных генах рРНК сильно отличается от компактной организации, которая видна даже в отдельной цепочке соседних нуклеосом в хроматиновой пити размером 10 нм (плотность упаковки которых равна 6). С другой стороны, из инфицированных клеток могут 380 Часть ЧН1. Упаковка ДНК .4 ее '. ЩР: я ° , е4"~ ,Ъа гт(Р г пн» ф и»»» ° гн ф~яр» Рис. 30.4. Вытянутая вдоль оси единица транскрипции рДНК переходит н несколько менее вытянутый негранскрибируемый спейсер.
)Фотография любезно пролосгннлонн СЬнг1ез Ьа1гд.) быть зкстрагированы транскрипционные комилексы мини-хромосом БЧ40. Они содержат обычный комплект гистонов и имеют структуру бусинок. Можно видеть цепи РНК, тянущиеся из мини-хромосом, как это показано на рис. 30.5. Из этого следует, что на ДНК вируса БЧ40 может происходить транскрипция, не нарушая нуклеосомной организации.
Мини-хромосома ЪЧ40 транскрибируется менее интенсивно, чем гены рРНК. Более редко транскрибируемые клеточные гены также можно наблюдать в виде частично вытянутых структур, в которых содержится меныпе нуклеосом, чем в петранскрибируемых областях. Другой подход к изучению этого вопроса заключается в расшеплении хроматина нуклеазой микрококков с последуюшим использованием зонда для определенного гена (или генов), чтобы установить наличие соответствующих фрагментов в обычной лестнице с шагом в 200 и.н. В таких экспериментах гены рРНК могут обнаруживаться во фракции нуклеосом. Однако всегда остается возможность, что эти определенные фрагменты происходят из некоторых нетранскрибируемых участков, тандемно входящих в исследуемый набор фрагментов.
Аналогичная проблема возникает при исследовании уникальных генов. В случае генов, которые транскрибируются не непрерывно, проблема заключается в том, что в клеточной популяции в каждый данный момент транскрибируются только некоторые гены. Для того чтобы преодолеть эту трудность, сравнивают сумму гибридизуюшихся с зондом последовательностей в мономерных фрагментах и в целой ДНК. При использовании зондов, соответствующих индивидуальным генам или популяциям мРНК (или в этом случае сателлитной ДНК), одни и те же результаты получают при гибридизации с нуклеосомными фрагментами и с целой ДНК.
Из этих экспериментов можно сделать ограниченные, но важные выводы. В генах, которые в данный момент транскрибируются, нуклеосомы расположены с такой же частотой, что и в нетранскрибируемых последовательностях. Таким образом, для транскрипции гены не должны обязательно принимать другую форму организации. Но, поскольку часть гена, связанная с молекулами РНК-полимеразы, может быть довольна мала, мы не можем судить о том, что происходит в местах, непосредственно связанных с ферментом.
Возможно, что нуклеосомы там сохраняются. Но, может быть, в местах следования РНК- полимеразы нуклеосомпая структура временно исчезает, а затем сразу восстанавливается, Эти эксперименты показывают также, что активные гены быстрее расщепляются до мономерных фрагментов, чем неактивные последовательности. Это может свидетельствовать о том, что, несмотря на нуклеосомную организацию, структура активных генов менее защищена. На примере некоторых генов теплового гпока у (г. гпе(аподаыег можно проиллюстрировать, что во время транскрипции в структуре нитей хроматина происходят определенные изменения.
В период, предшествующий тепловому шоку, эти гены транскрибируются не слишком часто, а обработка нуклеазой микрококков приводит к появлению типичной лестницы (указывающей на нуклеосомную организацию соответствующих районов). После теплового шока они активируются и затем начинают интенсивно транскрибироваться. Как видно из рне. 30.0, лестница в результате оказывается довольно смазанной, что указывает на изменение нуклеосомной организации. Природа такого изменения непонятна.
Такие воздействия, как разрезание хроматина под действием сил сдвига, могут уничтожить характерную реакцию на нуклеазу микрококков даже при сохранении нуклеосомной структуры. Таким образом, мы не можем сказать, исчезает ли лестница из-за того, что присутствие РНК-полимеразы (или других белков) затемняет картину, поскольку прн этом нарушается высокая упорядоченность структуры, или оттого, что нуклеосомы видоизменяются или паже совсем исчезают. ;,г,, 'г м-г. Рис 30.5. Мини-хромосома вируса 5Ч40 может транснрнбнронаться. )Фотогрнфнн любезно пролооглвленл Р1опо СЬлпзЬоп.) 30.
Нуклеосомы в активном хроматине л. Рнс. 30.6. До активации генов теплового шока н результа~е обработки нуклеазой мнкрекокков возникает отчетливая Нпепе шп пее е шп а лестница, которая становится смазанной после начала интенсивной транскрипция. пвптпграфнл любезно предоставлена Яатаь Е!жп.) Нт пееспн- е* пел На Рее аееннае нп Очевидно, что при интенсивной транскрипции гена происходят существенные структурные изменения. В случае генов рРНК это проявляется в исчезновении нуклеосом.
Но, возможно, это исключительный случай. С присутствием нуклеосом в умеренно транскрибируемых генах вполне согласуется предположение о том, что РНК-полимераза нарушает нуклеосомную структуру в точке транскрипции, но сразу после этого гистоновый октамер снова занимает свое место, если только другая молекула РНК-полимеразы не помешает ему это сделать. Домены, чувствительные к ДНКазе в транскрибируемом хроматине Важно дифференцировать две возможные причины изменения структуры хроматина в транскрибируемых участках. Поскольку в любой клетке транскрибнруется только характерное меньшинство последовательностей ДНК, должны существовать отличительные черты, по крайней мере у промоторов (а возможно, и по всей длине), этих единиц транскрипции.
Поэтому первым изменением должно быть некоторое событие, которое указывает аппарату транскрипции, что покус готов к экспрессии. В транскрибируемом гене должно произойти некоторое изменение структуры, хотя бы только в результате передвижения РНК-полимеразы по ДНК. Таким образом, структурные изменения могут быть следствием акта транскрипции, а не его причиной. Оценивая свойства транскрибируемых покусов, нам нужно определить, какие из его признаков существовалн до транскрипции в качестве ее предпосылки, а какие были нндуцированы потом как результат событий, вовлеченных в синтез РНК. При расщеплении хроматина ДНКазой 1 он деградирует в конце концов до кислоторастворимого материала )очень мелких фрагментов ДНК).
За общим ходом реакции можно проследить, определяя долю ДНК, перешедшей в кислоторастворимую фракцию. За судьбой же отдельного гена можно проследить, исследуя количество нерасщепившейся ДНК по ее способности вступать в реакцию со специфическим зондом (для этого обычно используются метод рестрикционного расшепления, блоттинг и гибридизацию). Схема такого опыта приведена на рис. 30.7. Основной подход заключается в том, что потеря определенной полосы свидетельствует о том, что именно этот участок переварен ферментом. Рнс. 30Л. Чувствительность к Днказе! можно измерить, определяя скорость исчезновения материала, гнбрнлнзуюшегося с данным зондом. 30. Нуклеосомы в активном хроматине 383 Чувствительность к ДНКазе обусловлена негистоновыми белками Чем обусловлено состояние чувствительности к ДНКазе? Чтобы выявить различия в чувствительности, которые могут быть связаны с изменениями в структуре хроматина, следует обратиться к не~ исгоновым белкам.
Чувствительный хроматин отличается по поведению некоторых НМО-белков. Два иегистоновых белка, НМО!4 и НМО17, преимущественно высвобождаются из хрома- тина при расщеплении ДНКазой 1. (НМО- от англ. Ь1яЬ шоЬ(йгу ягопр, т.е. высокомобильная группа маленьких негистоновых белков. Эти белки зкстрагируются из хроматина с помощью 0,35 М ХаС1, что указывает на их относительно непрочное связывание,) После экстракции этих белков глобиновый ген в хроматине зритроцитов не проявляет предпочтительной чувствительности к ДНКазе 1.
Однако чувствительность воссзанавливается при обратном добавлении этих белков к хроматину. из которого они были высолены. Эти белки не придают предпочтительной чувствительности глобиновым генам, если их добавить к хроматину мозга, обработанному таким же способом. Отскэда следует, что данный эффект зависит не только от НМО-белков. Глобиновые гены эритроцитов и мозга могут, по-виднмому, различаться по некоторому фактору, сохраняющемуся в хроматине после солевой зксзракции. Именно это различие позволяет хроматииу эритроцитов связывать белки НМО14 и НМО!7, образуя структуру, обусловливающую чувствительность ~лобиновых генов к ДНКазе. Один из этих двух белков (либо НМО14, либо НМО(7) эффекзнвен сам по себе. Добавления примерно одного моля НМО лостаточно для того, чтобы придать чувствительность каждой из ! 0 — 20 нуклеосом, выделенных из общей массы хроматииа.
Из это~о следует, что НМО может выбирать соответствующую мишень в препарате хроматнна. Такое же соотношение остается и для активно транскрибируемых генов, таких, как ген глобина, и для редко транскрнбируемых. Возникает ли чувствительность к ДНКазе на уровне индивидуальной нуклеосомы? Мономеры, выделенные в результате обработки нуклеазой микрококков, проявляют точно ту же чувствитсльностзь что и целыс ядра или хромагин. При удалении белков НМО!4 и НМО17 этот эффект исчезает и снова появляется при их добавлении.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
